Modelo in vivo de infecção de implante espinhal em camundongos

Summary

O protocolo descreve um novo modelo in vivo de infecção de implante espinhal em camundongos, onde um implante de fio k de aço inoxidável é infectado com Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescente. A carga bacteriana é monitorada longitudinalmente com imagens bioluminescentes e confirmada com contagens de unidades formadoras de colônias após a eutanásia.

Abstract

As infecções por implantes na coluna vertebral pressagiam resultados ruins, pois o diagnóstico é desafiador e a erradicação cirúrgica está em desacordo com a estabilidade mecânica da coluna vertebral. O objetivo deste método é descrever um novo modelo de camundongo de infecção por implante espinhal (SII) que foi criado para fornecer uma ferramenta in vivo barata, rápida e precisa para testar potenciais estratégias terapêuticas e de tratamento para infecções de implantes espinhais.

Neste método, apresentamos um modelo de cirurgia espinhal por abordagem posterior, no qual um fio k de aço inoxidável é transfixado no processo espinhoso L4 de camundongos selvagens C57BL/6J com 12 semanas de idade e inoculado com 1 x 10³ UFC de uma cepa bioluminescente da bactéria Staphylococcus aureus Xen36. Os camundongos são então fotografados longitudinalmente para bioluminescência in vivo nos dias de pós-operatório 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35. Sinais de imagem de bioluminescência (BLI) de um campo de visão padronizado são quantificados para medir a carga bacteriana in vivo.

Para quantificar as bactérias aderidas aos implantes e ao tecido peri-implantar, camundongos são eutanasiados e o implante e o tecido mole circundante são colhidos. As bactérias são destacadas do implante por sonicação, cultivadas durante a noite e, em seguida, as unidades formadoras de colônias (UFCs) são contadas. Os resultados obtidos a partir deste método incluem contagens bacterianas longitudinais medidas pela bioluminescência de S. aureus in vivo (fluxo máximo médio) e contagens de UFC após eutanásia.

Enquanto modelos animais anteriores de infecção instrumentada da coluna vertebral envolveram análise invasiva ex vivo de tecido, o modelo de SII em camundongos apresentado neste artigo aproveita imagens ópticas in vivo não invasivas e em tempo real de bactérias bioluminescentes para substituir o estudo de tecido estático. As aplicações do modelo são amplas e podem incluir a utilização de cepas bacterianas bioluminescentes alternativas, a incorporação de outros tipos de camundongos geneticamente modificados para estudar contemporaneamente a resposta imune do hospedeiro e avaliar as atuais ou investigar novas modalidades diagnósticas e terapêuticas, como antibióticos ou revestimentos de implantes.

Introduction

O objetivo deste método é descrever um novo modelo de infecção de implante espinhal (LIP) em camundongos. Esse modelo foi projetado para fornecer uma ferramenta barata e precisa para avaliar de forma flexível o efeito de variáveis do hospedeiro, patógeno e/ou implante in vivo. Testar potenciais estratégias terapêuticas e de tratamento para infecções de implantes espinhais neste modelo visa orientar o desenvolvimento de pesquisas antes da aplicação em modelos animais maiores e ensaios clínicos.

A infecção relacionada ao implante após cirurgia de coluna é uma complicação devastadora e, infelizmente, ocorre em aproximadamente 3% a 8% dos pacientes submetidos à cirurgia eletiva da coluna^vertebral 1,2,3,4,5 e em até 65% dos pacientes submetidos à cirurgia multinível ou de revisão⁶. O tratamento de infecções de implantes espinhais geralmente requer várias hospitalizações, múltiplas cirurgias e antibioticoterapia prolongada. As SIIs pressagiam resultados ruins para os pacientes, incluindo comprometimento neurológico, incapacidade e aumento do risco de mortalidade. O manejo da LIF é extremamente caro, custando mais de US$ 900.000 por paciente⁷.

Staphylococcus aureus é o patógeno virulento mais comum da LIF8,9,10,11. As bactérias podem semear o hardware diretamente durante a cirurgia, através da ferida durante o período pós-operatório, ou mais tarde via disseminação hematogênica. Na presença de implantes metálicos, o S. aureus forma biofilme que protege as bactérias da antibioticoterapia e das células imunes. Embora a remoção de hardware infectado possa ajudar efetivamente a erradicar uma infecção, isso frequentemente não é viável na coluna vertebral sem causar desestabilização e risco de comprometimento neurológico¹².

Na ausência de explantio de hardware infectado, novas abordagens são necessárias para prevenir, detectar e tratar SII. Historicamente, há modelos animais limitados de SII para avaliar eficientemente a segurança e eficácia de novas terapias. Modelos animais anteriores de LIF requerem grande número de animais e coleta de pontos de dados que requerem eutanásia, incluindo contagem de colônias, histologia e cultura^13,14,15. Na falta de monitoramento longitudinal in vivo, esses modelos fornecem apenas um ponto de dados por animal e, portanto, são caros e ineficientes.

Trabalhos anteriores estudando um modelo de infecção por artroplastia de joelho em camundongos estabeleceram o valor e a acurácia da imagem óptica in vivo não invasiva para monitorar longitudinalmente a carga de infecção¹⁶. A detecção de bioluminescência permite que a carga bacteriana seja quantificada ao longo de um curso longitudinal de tempo em um único animal de forma humana, precisa e eficiente. Além disso, estudos prévios demonstraram alta correlação entre bioluminescência in vivo e UFCs aderentes a implantes¹⁷. A capacidade de rastrear a infecção ao longo do tempo, levou a uma compreensão mais sutil da infecção relacionada ao implante. Além disso, monitorar a infecção longitudinal dessa forma permitiu avaliar com precisão a efetividade da antibioticoterapia e de novos antimicrobianos^16,17,18.

Aproveitando essas ferramentas, desenvolvemos e validamos um modelo de infecção pós-operatória de implante espinhal. No método apresentado, utilizamos um inóculo de S. aureus Xen36 bioluminescente para estabelecer um modelo in vivo de SII em camundongos para monitorar longitudinalmente a carga bacteriana16,17,18. Este novo modelo fornece uma ferramenta valiosa para testar eficientemente potenciais estratégias de detecção, prevenção e tratamento para SII antes de sua aplicação em modelos animais maiores e ensaios clínicos.

Protocol

Todos os animais foram manuseados em estrita conformidade com as boas práticas animais, conforme definido nas regulamentações federais, conforme estabelecido na Lei de Bem-Estar Animal (AWA), no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório de 1996, na Política PHS para o Cuidado e Uso Humano de Animais de Laboratório, bem como nas políticas e procedimentos da instituição, conforme estabelecido no Manual de Treinamento de Cuidados e Uso de Animais, e todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê d…

Representative Results

O procedimento aqui apresentado foi utilizado para avaliar a eficácia de esquemas de antibióticos em um modelo in vivo de SII em camundongos. Especificamente, a eficácia da antibioticoterapia combinada vancomicina e rifampicina foi comparada à vancomicina em monoterapia e controles infectados não tratados. Antes da cirurgia, os camundongos foram randomizados para terapia combinada, monoterapia ou controle infectado. Uma análise de poder estatístico foi realizada para calcular o tamanho …

Discussion

Infecções relacionadas ao implante na coluna vertebral pressagiam maus resultados para os pacientes 1,2,3,4,5. Ao contrário de muitas outras áreas do corpo, o hardware infectado na coluna frequentemente não pode ser removido devido ao risco de instabilidade e comprometimento neurológico. Esse desafio único no cenário de bactérias do biofilme resistent…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
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Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP