Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila
Summary
Présentés ici sont des méthodes détaillées pour la dissection et la coloration gouttelette de lipide des ovocytes dans les larves de Drosophila à l’aide de BODIPY 493/503, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques.
Abstract
Les lipides sont essentiels au développement des animaux et à l’homéostasie physiologique. La dysrégulation du métabolisme lipidique entraîne divers défauts et maladies du développement, tels que l’obésité et le foie gras. Habituellement, les lipides sont stockés dans des gouttelettes lipidiques, qui sont les organites multifonctionnels de stockage de lipides dans les cellules. Les gouttelettes lipidiques varient en taille et en nombre dans différents tissus et dans des conditions différentes. Il a été rapporté que les gouttelettes lipidiques sont étroitement contrôlées par la régulation de sa biogenèse et de la dégradation. Dans Drosophila melanogaster, l’oenocyte est un tissu important pour le métabolisme des lipides et a été récemment identifié comme un analogue du foie humain en ce qui concerne la mobilisation des lipides en réponse au stress. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la régulation du métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes restent insaisissables. Pour résoudre ce problème, il est de la plus haute importance de développer une méthode fiable et sensible pour visualiser directement les changements dynamiques des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. Profitant du BODIPY 493/503 lipophile, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques, décrit ici, est un protocole détaillé pour la dissection et la coloration subséquente des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes des larves de Drosophila en réponse à la famine. Cela permet une analyse qualitative de la dynamique des gouttelettes lipidiques dans diverses conditions par microscopie confocale. En outre, cette méthode rapide et hautement reproductible peut également être utilisée dans les écrans génétiques pour l’indentification de nouveaux facteurs génétiques impliquant le métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes et autres tissus.
Introduction
Les lipides sont essentiels à la survie cellulaire. En plus de leur rôle traditionnel en tant que composants intégrals des systèmes de membrane cellulaire, les lipides jouent également des fonctions cruciales dans l’approvisionnement en énergie et la transmission de signalisation tout au long des cycles de vie des animaux individuels1. Ainsi, le métabolisme des lipides doit se conformer à des règlements stricts pour maintenir l’hémostasie physiologique dans les cellules. On sait que la dysrégulation du métabolisme des lipides entraîne diverses maladies, comme le diabète et le foie gras. En dépit de la grande importance du métabolisme de lipide dans la santé animale, les mécanismes sous-jacents à la régulation de métabolisme de lipide restent largement inconnus.
Drosophila a été largement utilisé pendant des années depuis le professeur Thomas H. Morgan a commencé à les utiliser dans des études impliquant la génétique et d’autres questions biologiques de base2. Au cours des dernières décennies, de nouvelles preuves ont montré que Drosophila est un excellent organisme modèle dans l’étude de nombreuses maladies associées au métabolisme des lipides, telles que l’obésité1,3. En particulier, Drosophila partage des gènes métaboliques hautement conservés avec les humains et possède des tissus/organes et des types cellulaires pertinents similaires pour le métabolisme des lipides.
Par exemple, le corps gras de Drosophila, qui est responsable du stockage du triacylglycéride, fonctionne comme un tissu adipeux humain. Récemment, un groupe de cellules spécialisées de l’hépatocyte (c.-à-d., les oenocytes), qui ont été rapportés pour être un analogue fonctionnel au foie humain, ont été montrés pour être impliqués dans l’acide gras et le métabolisme d’hydrocarbures dans les mouches de fruit4,5. Semblable au cas dans les foies de mammifères, les oenocytes répondent à la famine en activant la formation de gouttelettes lipidiques dans la drosophilelarvaire et adulte Drosophila , résultant en l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans les ovocytes4,6,7,8. Anatomiquement, les oenocytes sont étroitement attachés à la surface interne basale de l’épiderme latéral en grappes d’environ six cellules par hémisegment abdominal, ce qui rend impossible d’isoler les amas d’oenocytes de l’épiderme. Ainsi, les oenocytes doivent être attachés à l’épiderme pendant la dissection et la coloration.
Les lipides sont stockés sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont des organites avec des membranes à une seule couche dans les cellules9. Les gouttelettes lipidiques existent dans presque tous les types de cellules à travers différentes espèces10. La dynamique des gouttelettes lipidiques, y compris sa taille et son nombre, change en réponse aux facteurs de stress environnementaux. Ceci est considéré comme un reflet de l’état métabolique en réponse au stress, comme le vieillissement et la famine7,8. Par conséquent, il est d’une grande importance de développer une méthode faisable et fiable pour déterminer qualitativement la dynamique des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. En particulier, dans la troisième larve instar, les ovocytes contiennent peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans des conditions nourries, mais ils contiennent de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques après la privation de nutrition4. Pour vérifier l’efficacité de cette méthode, il est suggéré d’effectuer la coloration des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes dans des conditions affamées.
Actuellement, plusieurs colorants lipophiles sont disponibles pour les gouttelettes lipidiques de coloration, tels que les colorants non fluorescents Soudan Noir et Huile Rouge O et colorants fluorescents Nile Red et BODIPY 493/50311. Soudan Noir et Huile Rouge O sont couramment utilisés pour les esters de cholesteryl tissu et triacylglycérols et peuvent être facilement détectés par microscopie légère. Cependant, la coloration de fond relativement élevée et la résolution relativement basse sont deux facteurs limitants pour ses applications dans l’analyse qualitative de la dynamique de gouttelette de lipide. Pour surmonter les limites des colorants non fluorescents, Nile Red et BODIPY 493/503 sont utilisés comme substituts idéaux pour la coloration des gouttelettes lipidiques. Il a été rapporté que le rouge du Nil peut également détecter un certain cholestérol non stérilisé, ce qui rend BODIPY 493/503 un colorant plus spécifique pour les gouttelettes lipidiques cellulaires, dans une certaine mesure12,13,14.
Par-dessus tout, pour répondre à un besoin d’analyse rapide et sensible des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes, ce protocole présente une méthode faisable et hautement reproductible de coloration à base fixative de gouttelettes lipidiques spécifiques utilisant BODIPY 493/503 comme colorant de tache. Dans ce rapport, les oenocytes sont disséqués, et BODIPY 493/503 est employé pour la coloration de gouttelette de lipide dans les oenocytes, dans lesquels des gouttelettes de lipide sont détectées par microscopie confocale. La facilité et l’abordabilité de cette procédure le rendent idéal pour la modification et l’utilisation ultérieure dans d’autres applications, telles que la cytométrie de flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parmi ceux décrits ci-dessus, il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, avec la période de ponte d’oeufs étant l’un de ces. En tant que tissu mobilisateur de lipides, l’oenocyte est très sensible au statut nutritionnel6,8. Des périodes prolongées de ponte peuvent entraîner une augmentation de la concurrence alimentaire avec les larves et les aliments, ce qui entraîne des résultats inexacts. La période de 1 h de pont utilisée dans ce protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 et 31601112), du projet 111 (D18010), du projet local d’innovation et de recherche du Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S155) et du China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
