Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae
Summary
Представлены здесь подробные методы для вскрытия и липидных капель окрашивания эноцитов в личинки Drosophila с использованием BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей.
Abstract
Липиды имеют важное значение для развития животных и физиологического гомеостаза. Дисрегуляция липидного обмена приводит к различным дефектам развития и заболеваниям, таким как ожирение и жировая печень. Как правило, липиды хранятся в липидных каплях, которые являются многофункциональными органеллами хранения липидов в клетках. Липидные капли различаются по размеру и количеству в разных тканях и при разных условиях. Сообщалось, что липидные капли жестко контролируются путем регулирования его биогенеза и деградации. В Drosophila melanogaster, эноцит является важной тканью для метаболизма липидов и недавно был определен в качестве аналога печени человека в отношении липидной мобилизации в ответ на стресс. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидных капель в эноцитах остаются неуловимыми. Для решения этой проблемы крайне важно разработать надежный и чувствительный метод для непосредственной визуализации липидных капель динамических изменений в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. Воспользовавшись липофильной BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей, описанный здесь подробный протокол для вскрытия и последующего липидных капель окрашивания в эноциты личинки Дрозофилы в ответ на голод. Это позволяет качественно анализировать динамику липидных капель в различных условиях с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, этот быстрый и высоко воспроизводимый метод может также быть использован в генетических экранах для инидентификации новых генетических факторов, связанных с метаболизмом липидных капель в эноцитах и других тканях.
Introduction
Липиды имеют важное значение для выживания клеток. В дополнение к своей традиционной роли в качестве интегральных компонентов клеточных мембранных систем, липиды также играют важнейшие функции в энергоснабжении и сигнализации трансдукции на протяжении всего жизненного цикла отдельных животных1. Таким образом, метаболизм липидов должен соответствовать строгим правилам для поддержания физиологического гемостаза в клетках. Известно, что дисрегуляция липидного обмена приводит к различным заболеваниям, таким как диабет и жировая печень. Несмотря на большое значение метаболизма липидов в здоровье животных, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидов, остаются в значительной степени неизвестными.
Дрозофила широко используется в течение многих лет, так как профессор Томас Х. Морган начал использовать их в исследованиях, связанных с генетикой и другими основными биологическими вопросами2. В последние несколько десятилетий, новые данные показали, что Drosophila является отличной моделью организма в изучении многих липидных метаболизма связанных заболеваний, таких как ожирение1,3. В частности, Drosophila делит высоки сохраненные метаболически гены с людьми и обладают подобными уместными тканями/органами и типами клетки для метаболизма липидов.
Например, жировое тело Дрозофилы,которое отвечает за хранение триацилглицерида, функционирует аналогично жировой ткани человека. В последнее время, кластер специализированных гепатоцитов, как клетки (т.е., эноциты), которые, как сообщается, функциональный аналог печени человека, было показано, что участвует в жирных кислот и углеводородного метаболизма у плодовых мушек4,5. Как и в случае с печенью млекопитающих, эноциты реагируют на голод, активируя образование липидных капель как у личинок, так и у взрослых дрозофил,что приводит к накоплению липидных капель в эноцитах4,6,8. Анатомически, эноциты плотно прикреплены к базальной внутренней поверхности боковой эпидермиса в кластерах примерно шесть клеток на гемиссегмент брюшной полости, что делает его невыполнимым, чтобы изолировать ээноциты кластеров от эпидермиса. Таким образом, эноциты должны быть прикреплены к эпидермису во время вскрытия и окрашивания.
Липиды хранятся в виде липидных капель, которые являются органеллами с однослойными мембранами в клетках9. Липидные капли существуют почти во всех типах клеток различных видов10. Динамика капель Липид, включая ее размер и количество, меняется в ответ на экологические стрессы. Это рассматривается как отражение метаболического статуса в ответ на стресс, такие как старение и голод7,8. Поэтому очень важно разработать осуществимый и надежный метод для качественного определения динамики липидных капель в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. В частности, в третьем instar личинок, эноциты содержат мало или нет обнаруживаемых липидных капель при кормах, но они содержат многочисленные большие липидные капли после лишения питания4. Для проверки эффективности этого метода, предлагается для выполнения липидных капель окрашивания в эноциты в голодных условиях.
В настоящее время несколько липофильных красителей доступны для липидных капель окрашивания, таких как нефторные красители Судан Черный и Масло Красный O и флуоресцентные красители Нила Красный и BODIPY 493/50311. Судан Черный и Масло Красный O обычно используются для ткани холестерина эстеры и triacylglycerols и могут быть легко обнаружены с помощью световой микроскопии. Тем не менее, относительно высокое окрашивание фона и относительно низкое разрешение являются двумя ограничивающими факторами для его применения в качественном анализе динамики липидных капель. Для преодоления ограничений нефлуоресцентных красителей, Нил Красный и BODIPY 493/503 используются в качестве идеальной замены для липидных капель окрашивания. Было сообщено, что Нил Красный может также обнаружить некоторые unesterified холестерина, что делает BODIPY 493/503 более специфический краситель для клеточных капель липидов, в некоторой степени12,13,14.
Прежде всего, для выполнения необходимости быстрого и чувствительного анализа липидных капель в эноцитах, этот протокол представляет собой осуществимый и высоко воспроизводимый метод фиксаторской основе липидных капель конкретных окрашивания с помощью BODIPY 493/503 как пятно красителя. В этом отчете, эноциты вскрыты, и BODIPY 493/503 используется для липидных капель окрашивания в эноциты, в которых липидные капли обнаруживаются с помощью конфокальной микроскопии. Простота и доступность этой процедуры делают ее идеальной для модификации и дальнейшего использования в других приложениях, таких как цитометрия потока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Среди тех, изложенных выше, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, с яйцом отложить период времени является одним из них. Как липид-мобилизационная ткань, эноцит очень чувствителен к состоянию питания6,8. Длительные периоды откладки яиц могут приве?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31671422, 31529004 и 31601112), проектом 111 (D18010), местным проектом инновационных и исследовательских групп программы Гуандун-Перл-Ривер Таланты (2017BT01S155), а также Китайский фонд постдокторской науки (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
