Summary

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Published: December 28, 2019
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Summary

Presentati qui sono i metodi dettagliati per la dissezione e la colorazione delle goccioline lipidiche degli ovociti nelle larve di Drosophila utilizzando BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per gocciolaiole lipidiche.

Abstract

I lipidi sono essenziali per lo sviluppo animale e l’omeostasi fisiologica. Disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in vari difetti dello sviluppo e malattie, come l’obesità e fegato grasso. Di solito, i lipidi sono memorizzati in goccioline lipidiche, che sono gli organelli di conservazione lipidica multifunzionale nelle cellule. Le goccioline di lipidi variano per dimensioni e numero in tessuti diversi e in condizioni diverse. È stato riferito che le goccioline di lipidi sono strettamente controllate attraverso la regolazione della sua biogenesi e degradazione. In Drosophila melanogaster, l’enocito è un tessuto importante per il metabolismo dei lipidi ed è stato recentemente identificato come un analogo del fegato umano per quanto riguarda la mobilitazione dei lipidi in risposta allo stress. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo delle goccioline lipidi che si sono mantilati rimangono sfuggente. Per risolvere questo problema, è della massima importanza sviluppare un metodo affidabile e sensibile per visualizzare direttamente i cambiamenti dinamici delle goccioline di lipidi negli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. Approfittando del LIPophilic BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per le gocciolaiate di lipidi, descritto qui, è un protocollo dettagliato per la dissezione e la successiva macchiatura di idropidi nei lipidi delle larve di Drosophila in risposta alla fame. Ciò consente un’analisi qualitativa della dinamica delle gocciolamenti lipidiche in varie condizioni mediante microscopia confocale. Inoltre, questo metodo rapido e altamente riproducibile può essere utilizzato anche negli schermi genetici per identificare nuovi fattori genetici che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono gli enociti e altri tessuti.

Introduction

I lipidi sono essenziali per la sopravvivenza delle cellule. Oltre al loro ruolo tradizionale come componenti integrali dei sistemi di membrana cellulare, i lipidi svolgono anche funzioni cruciali nell’approvvigionamento energetico e nella trasduzione della segnalazione durante i cicli di vita dei singoli animali1. Pertanto, il metabolismo dei lipidi deve conformarsi a rigide normative per mantenere l’emostasi fisiologica nelle cellule. È noto che la disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in varie malattie, come il diabete e fegato grasso. Nonostante la grande importanza del metabolismo dei lipidi nella salute degli animali, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo dei lipidi rimangono in gran parte sconosciuti.

La Drosophila è stata ampiamente utilizzata per anni da quando il professor Thomas H. Morgan ha iniziato a usarli in studi che coinvolgono la genetica e altre domande biologiche di base2. Negli ultimi decenni, prove emergenti hanno dimostrato che la Drosophila è un organismo modello eccellente nello studio di molte malattie legate al metabolismo dei lipidi, come l’obesità1,3. In particolare, la Drosophila condivide geni metabolici altamente conservati con gli esseri umani e possiede tessuti/organi e tipi di cellule rilevanti simili per il metabolismo dei lipidi.

Ad esempio, il corpo grasso della Drosophila, che è responsabile dell’immagazzinamento del triacylgliceride, funzioni analoghe al tessuto adiposo umano. Recentemente, un gruppo di cellule specializzate epatociti -come (cioè, ovociti), che sono stati segnalati per essere un analogo funzionale al fegato umano, hanno dimostrato di essere coinvolti nel metabolismo dell’acido grasso e degli idrocarburi nei moscerini della frutta4,5. Simile al caso nei fegati di mammiferi, gli enociti rispondono alla fame attivando la formazione di gocciolini ilipidi nella Drosophilalarvale e adulta , con conseguente accumulo di goccioline lipidiche in enociti4,6,7,8. Anatomicamente, gli oenociti sono strettamente attaccati alla superficie interna basale dell’epidermide laterale in grappoli di circa sei cellule per emisegmento addominale, il che rende impraticabile isolare gli ammassi di enociti dall’epidermide. Pertanto, gli ovociti devono essere attaccati all’epidermide durante la dissezione e la colorazione.

I lipidi sono memorizzati sotto forma di goccioline di lipidi, che sono organelli con membrane a strato singolo nelle cellule9. Goccioline di lipidi esistono in quasi tutti i tipi di cellule in diverse specie10. Le dinamiche delle goccioline lipidiche, comprese le dimensioni e il numero, cambiano in risposta a fattori di stress ambientali. Questo è considerato come un riflesso dello stato metabolico in risposta allo stress, come l’invecchiamento e la fame7,8. Pertanto, è di grande importanza sviluppare un metodo fattibile e affidabile per determinare qualitativamente le dinamiche delle goccioline lipidiche nelle dinamiche degli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. In particolare, nelle larve a stella, gli enociti contengono poche o nessuna goccioline di lipidi rilevabili in condizioni di alimentazione, ma contengono numerose grandi goccioline di lipidi dopo la privazione nutrizionale4. Per verificare l’efficacia di questo metodo, si consiglia di eseguire la colorazione delle goccioline lipidiche negli enociti in condizioni di fame.

Attualmente, sono disponibili diversi coloranti lipofilici per la colorazione delle goccioline lipidiche, come i coloranti non fluorescenti Sudan Black and O.O. Sudan Nero e olio Rosso O sono comunemente utilizzati per esteri di colesterile dei tessuti e triacylglycerol e possono essere facilmente rilevati dalla microscopia leggera. Tuttavia, la colorazione di fondo relativamente elevata e la risoluzione relativamente bassa sono due fattori limitanti per le sue applicazioni nell’analisi qualitativa delle dinamiche delle goccioline lipidiche. Per superare i limiti dei coloranti non fluorescenti, Nile Red e BODIPY 493/503 sono utilizzati come sostituti ideali per la colorazione delle goccioline lipidiche. È stato riferito che Il Nilo Red può anche rilevare un po ‘di colesterolo non esterificato, il che rende BODIPY 493/503 un tintio più specifico per le goccioline di lipidi cellulari, in una certa misura12,13,14.

Soprattutto, per soddisfare la necessità di un’analisi rapida e sensibile delle goccioline lipidiche negli enociti, questo protocollo presenta un metodo fattibile e altamente riproducibile di colorazione lipidica-specifica basato su fissativo utilizzando BODIPY 493/503 come colorante macchia. In questo rapporto, gli enociti vengono sezionati e BODIPY 493/503 viene utilizzato per la colorazione delle goccioline di lipidi negli enociti, in cui le goccioline di lipidi vengono rilevate dalla microfocalscopia. La facilità e la convenienza di questa procedura lo rendono ideale per la modifica e l’ulteriore utilizzo in altre applicazioni, come la citometria di flusso.

Protocol

1. Deposizione delle uova Preparare il cibo standard per la deposizione delle uova. NOT:</ Per la ricetta e la procedura di cottura per il cibo standard di farina di mais utilizzato qui, vedere i dettagli pubblicati in precedenza15. Preparare la pasta di lievito fresco aggiungendo 6 mL di acqua distillata a 4 g di lievito essiccato attivo in un tubo centrifugo da 50 mL. Utilizzare una spatola per mescolare e fare una pasta. Fare bottiglie di …

Representative Results

La riuscita esecuzione di questa procedura dovrebbe risultare in una chiara colorazione delle goccioline di lipidi che rivela il numero e le dimensioni delle goccioline di lipidi negli enociti. La figura 1A,A’,A” mostra che ci sono poche goccioline lipidiche rilevabili (punti verdi) negli enociti delle normali larve di alimentazione durante le diverse fasi dello sviluppo. La figura 1B,B’,B” mos…

Discussion

Tra quelli sopra descritti, ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo, con il periodo di deposizione delle uova essendo uno di questi. Come tessuto lipidico-mobilizzante, l’enocito è altamente sensibile allo stato nutrizionale6,8. Periodi di tempo prolungati per la deposizione delle uova possono provocare larve cantata e una maggiore concorrenza alimentare, portando a risultati imprecisi. Il periodo di deposizione delle uova di 1 h utilizzato in ques…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), dal Progetto 111 (D18010), dal Local Innovative and Research Teams Project del Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S15) e dal China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).

Materials

50 mL centrifuge tube Corning 430829 50 mL
6 cm Petri dish Thermo Fisher 150326 6 cm
Agar For fly food
Aluminum foil N/A N/A Protect smaple from light
BODIPY 493/503 Invitrogen D3922 Lipid droplet staining dye
Confocal microscope Leica Leica TSC SP5 Confocal imaging
Corn syrup For fly food
Cornmeal For fly food
Coverslip Citoglas 10212424C 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin N/A N/A
Dissection plate N/A N/A
Filter paper N/A N/A Diameter: 11 cm
Fixation buffer N/A N/A 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS
Forcep Dumont 11252-30 #5
Incubator Jiangnan SPX-380 For fly culture
Microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C 1.5 ml
Microscopy slide Citoglas 10127105P-G
Mounting medium VECTASHIELDAntifade Mounting Medium H-1000 Antifade mounting medium
Nail polish PanEra AAPR419 Seal the coverslip
Paintbrush N/A N/A
PBS N/A N/A 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator Kylin-Bell Lab Instruments WH-986
Scissor Smartdata Medical SR81 Vannas spring scissor
Soy flour For fly food
Spatula N/A N/A
Standard cornmeal food N/A N/A Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope Leica Leica S6E For tissue dissection
Wipe paper N/A N/A
Yeast For fly food
yw Kept as lab stock N/A Drosophila

References

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Cite This Article
Wei, C., Yan, Y., Miao, X., Jiao, R. Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (154), e60606, doi:10.3791/60606 (2019).

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