Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Summary

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all’interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Abstract

Gli eventi cellulari chiave come la trasduzione del segnale e il traffico di membrana si basano sulla corretta posizione delle proteine all’interno dei compartimenti cellulari. Comprendere con precisione la localizzazione subcellulare delle proteine è quindi importante per rispondere a molte domande biologiche. La ricerca di un’etichetta robusta per identificare la localizzazione delle proteine combinata con un’adeguata conservazione cellulare e colorazione è stata storicamente impegnativa. I recenti progressi nell’imaging della microscopia elettronica (EM) hanno portato allo sviluppo di molti metodi e strategie per aumentare la conservazione cellulare ed etichettare le proteine bersaglio. Un tag genetico relativamente nuovo basato sulla perossidasi, APEX2, è un leader promettente nei tag eM-active clonabili. La preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è avanzata anche negli ultimi anni con l’avvento della criofissia mediante congelamento ad alta pressione (HPF) e disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite sostituzione del congelamento (FS). HPF e FS forniscono un’eccellente conservazione dell’ultrastruttura cellulare per l’imaging TEM, secondo solo per la crio-imaging diretto di campioni vitrei. Qui presentiamo un protocollo per il metodo cryoAPEX, che combina l’uso del tag APEX2 con HPF e FS. In questo protocollo, una proteina di interesse è contrassegnata con APEX2, seguita da fissazione chimica e reazione alla perossida. Al posto della colorazione tradizionale e della disidratazione dell’alcool a temperatura ambiente, il campione viene criofatto e subisce disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite FS. Utilizzando cryoAPEX, non solo è possibile identificare una proteina di interesse all’interno dei compartimenti subcellulari, ma anche informazioni aggiuntive possono essere risolte rispetto alla sua topologia all’interno di una membrana strutturalmente conservata. Dimostriamo che questo metodo può fornire una risoluzione sufficientemente elevata da decifrare i modelli di distribuzione delle proteine all’interno di un lume di organello e distinguere la compartimentazione di una proteina all’interno di un organello in prossimità di altri organelli non etichettati. Inoltre, crioAPEX è proceduralmente semplice e suscettibile alle cellule coltivate nella coltura tissutale. Non è più impegnativo dal punto di vista tecnico rispetto ai tipici metodi di criofissazione e sostituzione del congelamento. CryoAPEX è ampiamente applicabile per l’analisi TEM di qualsiasi proteina di membrana che può essere etichettata geneticamente.

Introduction

Gli studi biologici spesso includono questioni di risoluzione della localizzazione delle proteine subcellulari all’interno di cellule e organelli. La microscopia a immunofluorescenza fornisce un’utile visione a bassa risoluzione della localizzazione delle proteine, e recenti progressi nell’imaging a super-risoluzione stanno spingendo i limiti di risoluzione per le proteine fluorescenti^{marcate 1,2,3}. Tuttavia, la microscopia elettronica (EM) rimane lo standard d’oro per l’imaging dell’ultrastruttura cellulare ad alta risoluzione, anche se l’etichettatura delle proteine è una sfida.

Storicamente, diversi metodi EM sono stati utilizzati per affrontare questioni di localizzazione delle proteine ultrastrutturali. Uno dei metodi più comunemente utilizzati è la microscopia immunoelettronica (IEM), in cui gli anticorpi primari specifici dell’antigene vengono utilizzati per rilevare la proteina di interesse. Il segnale EM è generato dall’applicazione di anticorpi secondari coniugati con particelle ad alta densità di elettroni, più comunemente oro colloidale^4,5. In alternativa, gli anticorpi coniugati con enzimi come la perossidasi di ravanello (HRP) possono essere utilizzati per produrre un precipitato ad alta densità di elettroni^6,7,8. Esistono due approcci principali per IEM, denominati pre-incorporamento e post-incorporazione. Nel pre-incorporamento IEM, gli anticorpi vengono introdotti direttamente nelle cellule, il che richiede la fissazione della luce e la permeabilizzazione delle cellule^9,10,11. Entrambi i passaggi possono danneggiare^{l’ultrastruttura 12,13}. Lo sviluppo di anticorpi significativamente più piccoli costituiti da un frammento di Fab di corpo coniugato con 1,4 nm nanogold consente di utilizzare condizioni di permeabilizzazione molto delicate; tuttavia, il nanooro è troppo piccolo per la visualizzazione diretta in TEM e richiede ulteriori passaggi di miglioramento per diventare visibile^14,15,16. Nell’IEM post-incorporamento, gli anticorpi vengono applicati su sottili sezioni di cellule che sono state completamente elaborate per fissazione, disidratazione e incorporamento in resina¹⁷. Mentre questo approccio evita la fase di permeabilizzazione, preservare l’epitopo di interesse durante la preparazione del campione è impegnativo^18,19,20. Il metodo Tokuyasu di fissazione della luce seguito da congelamento, crio-sezione, e il rilevamento degli anticorpi fornisce una migliore conservazione dell’epitopo^21,22. Tuttavia, i requisiti tecnici della crio-ultramicrotomia, così come il contrasto non ottimale ottenuto nella cellula, sono svantaggi²³.

L’uso di tag geneticamente codificati elimina molte delle difficoltà dell’IEM legate alla rilevazione della proteina di interesse. Sono disponibili diversi tag, tra cui HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Ognuno di questi ha vantaggi rispetto ai metodi precedenti, ma ognuno ha anche svantaggi che impediscono l’uso diffuso. Questi inconvenienti vanno dall’inattività di HRP nel citosol alle grandi dimensioni del tag di ferritina, sensibilità alla luce di ReAsH, e piccole dimensioni e mancanza di compatibilità con la colorazione cellulare di metallothionein. Recentemente, una proteina derivata da ascorbate peroxidase è stata progettata come tag EM, chiamato APEX2^33,34. Come perossidasi, APEX2 può catalizzare l’ossidazione di 3,3′ didiaminobenzidina (DAB), producendo un precipitato che reagisce con teossido di osmio per fornire contrasto EM locale con una diffusione minima dalla proteina di interesse (meno di 25 nm)^33,35. A differenza dei metodi tradizionali basati su HRP, APEX2 è estremamente stabile e rimane attivo in tutti i compartimenti cellulari³³. I campioni possono essere elaborati per TEM utilizzando la colorazione tradizionale dei campioni EM e metodi che consentono una buona visualizzazione delle strutture circostanti^33,34,36. Grazie alle sue piccole dimensioni, stabilità e versatilità, APEX2 è emerso come un tag EM con un grande potenziale.

Molti degli approcci discussi in precedenza non possono essere o non sono ancora stati combinati con lo stato attuale dell’arte nella conservazione ultrastrutturale, nella criofissia e nella sostituzione del congelamento a bassa temperatura. Così, soffrono di una mancanza di conservazione della membrana e/o colorazione cellulare per determinare la localizzazione accurata delle proteine. Ciò limita necessariamente la risoluzione e l’interpretazione dei dati che possono essere ottenuti. La criofixazione mediante il congelamento ad alta pressione (HPF) comporta il congelamento rapido di campioni in azoto liquido ad alta pressione (2.100 bar), che causa la vetrificazione piuttosto che la cristallizzazione dei campioni acquosi, preservando così le cellule in uno stato quasi nativo^37,38,39. L’HPF è seguita da una sostituzione di congelamento (FS), una disidratazione a bassa temperatura (-90 gradi centigradi) in acetone combinata con incubazione con le tipiche macchie EM come il tetrossido di osmio e l’acetato uranico. HPF e FS insieme offrono un netto vantaggio rispetto alla fissazione chimica tradizionale (un processo più lungo che può portare a manufatti) e alla disidratazione dell’alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio (che può portare all’estrazione di lipidi e zuccheri), e quindi possono combinarsi con i migliori tag EM per il rilevamento delle proteine.

Uno dei motivi per cui HPF/FS non è stato combinato con l’etichettatura APEX2 è che la fissazione chimica della luce è un prerequisito per la reazione alla perossia, limitando la diffusione del prodotto di reazione DAB. Negli studi APEX2 finora, fissazione e reazione alla perossida sono seguiti dai metodi Tradizionali EM per la colorazione e la disidratazione dell’alcol^33,36. Tuttavia, è stato dimostrato che dopo la fissazione chimica con HPF/FS fornisce un netto vantaggio nella conservazione rispetto alla fissazione chimica tradizionale e alla disidratazione dell’alcool da solo⁴⁰. La perdita di integrità ultrastrutturale osservata nei campioni TEM tradizionali appare meno connessa alla fissazione che alla disidratazione, che in genere avviene usando alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio, e può portare all’estrazione di lipidi e zuccheri^40,41. Per sviluppare il metodo cryoAPEX, abbiamo ipotizzato che la fissazione chimica e la reazione perossidasi, seguite da HPF e FS, produrrebbero un risultato ottimale in termini di conservazione ultrastrutturale.

Qui presentiamo il protocollo cryoAPEX, che combina l’etichettatura APEX2 con i metodi di criofixation e di sostituzione del congelamento (Figura 1). Questo protocollo semplice consiste nella trasfezione di una proteina marcata APEX2 di interesse, fissazione chimica delle cellule e reazione alla perossida. HPF e FS vengono quindi eseguite seguite dall’incorporamento tipico della resina e dal sezionamento sottile. L’imaging TEM rivela un’eccellente conservazione dell’ultrastruttura utilizzando questo metodo. Inoltre, sono state osservate la localizzazione subcellulare ad alta risoluzione e la distribuzione spaziale di una proteina lumena endolasmica (ER). Questo metodo è ampiamente utile per rilevare la localizzazione della proteina membrana all’interno delle cellule per l’analisi della microscopia elettronica. Nelle nostre mani, il metodo ha funzionato con successo per una varietà di linee cellulari coltivate nella coltura dei tessuti, tra cui HEK-293T (rene embrionale umano), HeLa (cancro cervicale umano), Cos7 (fibroblasto renale della scimmia verde africana) e BHK (rene di criceto del bambino). Le istruzioni dettagliate sono descritte di seguito utilizzando le cellule HEK-293T.

Protocol

1. Cultura cellulare e trasfezione Seme HEK-293T cellule su un 60 mm di diametro o più grande piatto di coltura tissutale e crescere al 60%-90% di confluenza in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% CO2. Cellule transfettrali con plasmidi di espressione dei mammiferi marcati APEX2 che utilizzano il reagente di trasfezione (vedi Tabella dei materiali)secondo le indicazioni del produttore. A 12-15 h dopo la trasfezione, lavare le cellule una…

Representative Results

Al fine di confrontare la conservazione ultrastrutturale utilizzando il metodo crioAPEX con la fissazione tradizionale e la disidratazione, abbiamo preparato campioni in cui una membrana del reticolo endolasmico (ERM; il peptide ER membrana) è stato etichettato con APEX2 e trasvenuto nelle cellule HEK-293T. ERM-APEX2 localizza la faccia citoplasmica del ER e rimodella la struttura ER in strutture morfologicamente distinte conosciute come organizzato liscio ER (OSER)34,<sup class="xref"…

Discussion

Il protocollo cryoAPEX qui presentato fornisce un metodo robusto per caratterizzare la localizzazione delle proteine della membrana all’interno dell’ambiente cellulare. Non solo l’uso di un tag APEX2 geneticamente codificato fornisce una localizzazione precisa di una proteina di interesse, ma l’uso della criofissia e della disidratazione a bassa temperatura fornisce un’eccellente conservazione e colorazione dell’ultrastruttura cellulare circostante. Combinati, questi approcci sono un potente strumento per localizzare una…

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400