O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Summary

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

Abstract

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Introduction

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentes^{marcadas 1,2,3}. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.

Historicamente, vários métodos EM têm sido usados para abordar questões de localização de proteínas ultraestruturais. Um dos métodos mais utilizados é a microscopia imunoeletrônica (IEM), onde anticorpos primários específicos de antígeno são usados para detectar a proteína de interesse. O sinal EM é gerado pela aplicação de anticorpos secundários conjugados com partículas densas eletrônicas, mais comumente ouro coloidal^4,5. Alternadamente, anticorpos conjugados com enzimas como peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) podem ser usados para produzir um precipitado elétron-denso^6,7,8. Existem duas abordagens principais para o IEM, denominada rotulagem pré-incorporação e post-incorporação. Na pré-incorporação do IEM, os anticorpos são introduzidos diretamente nas células, o que requer fixação de luz e permeabilização das células^9,10,11. Ambas as etapas podem danificar a ultraestrutura^12,13. O desenvolvimento de anticorpos significativamente menores que consistem em um fragmento fab anticorpo conjugado com nanogold de 1,4 nm permite que condições muito suaves de permeabilização sejam usadas; no entanto, o nanogold é muito pequeno para visualização direta TEM e requer passos adicionais de aprimoramento para se tornar visível^14,15,16. No IEM pós-incorporação, os anticorpos são aplicados em finas seções de células que foram totalmente processadas por fixação, desidratação e incorporação em resina¹⁷. Embora essa abordagem evite a etapa de permeabilização, preservar o epítopo de interesse ao longo da preparação da amostra é desafiador^18,19,20. O método tokuyasu de fixação de luz seguido de congelamento, seção crio-seccional e detecção de anticorpos fornece melhor preservação de epitope^21,22. No entanto, os requisitos técnicos da crio-ultramicrotomia, bem como o contraste abaixo do ideal alcançado na célula, são desvantagens²³.

O uso de tags geneticamente codificadas elimina muitas das dificuldades do IEM relacionadas à detecção da proteína de interesse. Estão disponíveis uma variedade de tags, incluindo HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Cada um deles tem vantagens em relação aos métodos anteriores, mas cada um também tem desvantagens impedindo o uso generalizado. Essas desvantagens vão desde a inatividade de HRP no citosol até o grande tamanho da tag de ferritina, sensibilidade à luz do ReAsH, e tamanho pequeno e falta de compatibilidade com a coloração celular de metallothioneina. Recentemente, uma proteína derivada da peroxidase ascorbate foi projetada como uma tag EM, chamada APEX2^33,34. Como peroxidase, o APEX2 pode catalisar a oxidação de 3,3′ diaminobenzidina (DAB), produzindo um precipitado que reage com tetróxido de osmômio para fornecer contraste EM local com difusão mínima da proteína de interesse (menos de 25 nm)^33,35. Ao contrário dos métodos tradicionais baseados em HRP, o APEX2 é extremamente estável e permanece ativo em todos os compartimentos celulares³³. As amostras podem ser processadas para TEM usando a coloração tradicional da amostra EM e métodos que permitem uma boa visualização das estruturas circundantes^33,34,36. Devido ao seu pequeno tamanho, estabilidade e versatilidade, a APEX2 emergiu como uma tag EM com grande potencial.

Muitas das abordagens discutidas acima não podem ser ou ainda não foram combinadas com o estado atual da arte em preservação ultraestrutural, criofixação e substituição de congelamento de baixa temperatura. Assim, sofrem com a falta de preservação da membrana e/ou coloração celular para determinar a localização precisa das proteínas. Isso limita necessariamente a resolução e interpretação dos dados que podem ser obtidos. A criofixação por congelamento de alta pressão (HPF) envolve o congelamento rápido de amostras em nitrogênio líquido a uma alta pressão (~2.100 bar), o que causa vitrificação em vez de cristalização de amostras aquosas, preservando assim células em um estado quase nativo^37,38,39. O HPF é seguido por substituição de congelamento (FS), uma desidratação de baixa temperatura (-90 °C) em acetona combinada com incubação com manchas típicas em como tetróxido de osmó e acetato de uranyl. HPF e FS juntos fornecem uma vantagem distinta sobre a fixação química tradicional (um processo mais longo que pode levar a artefatos) e desidratação alcoólica à temperatura ambiente ou no gelo (o que pode levar à extração de lipídios e açúcares), e, portanto, são desejáveis para combinar com as melhores tags EM para detecção de proteínas.

Uma das razões pelas quais o HPF/FS não foi combinado com a rotulagem APEX2 é que a fixação química leve é um pré-requisito para a reação peroxidase, limitando a difusão do produto de reação DAB. Nos estudos da APEX2 até agora, a fixação e a reação peroxidase são seguidas pelos métodos tradicionais em para coloração e desidratação alcoólica^33,36. No entanto, mostrou-se que após a fixação química com o HPF/FS fornece uma vantagem distinta na preservação sobre a fixação química tradicional e a desidratação do álcool sozinha⁴⁰. A perda de integridade ultraestrutural vista em amostras tradicionais de TEM parece menos ligada à fixação do que à desidratação, que normalmente é feita usando álcool à temperatura ambiente ou no gelo, e pode levar à extração de lipídios e açúcares^40,41. Para desenvolver o método crioAPEX, suporam que a fixação química e a reação peroxidase, seguida séfeio e FS, produziriam um resultado ideal em termos de preservação ultraestrutural.

Aqui apresentamos o protocolo crioAPEX, que combina marcação APEX2 com métodos de criofixação e congelamento de métodos de substituição(Figura 1). Este protocolo simples consiste na transfecção de uma proteína de interesse apex2 marcada, fixação química das células e reação peroxidase. HPF e FS são então realizados seguidos de incorporação típica de resina e secção fina. A imagem TEM revela excelente preservação da ultraestrutura usando esse método. Além disso, observou-se localização subcelular de alta resolução e distribuição espacial de uma proteína lumenal de retículo endoplasmático (ER). Este método é amplamente útil para detecção da localização da proteína da membrana dentro das células para análise de microscopia eletrônica. Em nossas mãos, o método tem trabalhado com sucesso para uma variedade de linhas celulares cultivadas na cultura tecidual, incluindo HEK-293T (rim embrionário humano), HeLa (câncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de macaco verde africano) e BHK (rim de hamster bebê). Instruções detalhadas são descritas abaixo usando células HEK-293T.

Protocol

1. Cultura Celular e Transfecção As células HEK-293T de sementes em um prato de 60 mm de diâmetro ou cultura tecidual maior e crescem para 60% a 90% de confluência em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2. Células transfect com plasmídeos de expressão mamífero com apex2 com marca ção de forma ativa da transfecção usando reagente transfection (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Às 12 h e 15 h após a…

Representative Results

Para comparar a preservação ultraestrutural utilizando o método crioAPEX com fixação e desidratação tradicionais, preparamos amostras em que uma membrana retícula endoplasmática (ERM; O peptídeo da membrana ER foi marcado com APEX2 e transfecdo em células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza a face citoplasmática do PS e remodela a estrutura ER em estruturas morfologicamente distintas conhecidas como ER (OSER)34,42,43. A mor…

Discussion

O protocolo crioAPEX aqui apresentado fornece um método robusto para caracterizar a localização das proteínas da membrana dentro do ambiente celular. Não só o uso de uma tag APEX2 geneticamente codificada fornece localização precisa de uma proteína de interesse, mas o uso de criofixação e desidratação de baixa temperatura proporciona excelente preservação e coloração da ultraestrutura celular circundante. Combinados, essas abordagens são uma poderosa ferramenta para localizar uma proteína com alta prec…

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400