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Biology

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

Published: February 27, 2020
doi:
10.3791/60677
, , ,
1Department of Biological Sciences,Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology,Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease,Purdue University, 4Bindley Biosciences Center,Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience,Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research,Purdue University

Summary

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。

Abstract

シグナル伝達や膜の密転のような主要な細胞イベントは、細胞コンパートメント内の適切なタンパク質位置に依存します。タンパク質の正確な細胞内局在化を理解することは、多くの生物学的な質問に答えるために重要です。タンパク質の局在化と適切な細胞保存と染色を組み合わせた堅牢なラベルの探求は、歴史的に困難でした。電子顕微鏡(EM)イメージングの最近の進歩は、細胞の保存と標識標的タンパク質を増加させる多くの方法と戦略の開発につながっています。比較的新しいペルオキシダーゼベースの遺伝的タグであるAPEX2は、クローン可能なEM活性タグの有望なリーダーです。透過型電子顕微鏡(TEM)の試料調製も近年、高圧凍結(HPF)によるクライオフィク沈作の出現と、凍結置換(FS)による低温脱水および染色の出現とともに進んでいる。HPFおよびFSは、TEMイメージングのための細胞超構造の優れた保存を提供し、第2は、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的な光子試料のイメージングを行う。ここでは、Apex2 タグを HPF と FS と組み合わせた cryoAPEX メソッドのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、目的のタンパク質にAPEX2がタグ付けされ、続いて化学固定とペルオキシダーゼ反応が行われます。従来の染色や室温でのアルコール脱水の代わりに、試料を凍結固定し、FS経由で低温で脱水と染色を行います。CryoAPEXを使用すると、目的のタンパク質を細胞内のコンパートメント内で識別できるだけでなく、構造的に保存された膜内のそのトポロジーに関して追加情報を解決することができます。この方法は、オルガネラ内のタンパク質分布パターンを解読し、1つのオルガネラ内のタンパク質の区画化を他の未標識オルガネラに近接して区別するのに十分な高い解像度を提供できることを示す。また、CryoAPEXは、組織培養で増殖した細胞に対して手続き的に簡単かつ受け入れやすい。これは、典型的なクライオフィクセションと凍結置換方法と同じ技術的に困難ではありません。CryoAPEXは、遺伝的にタグ付けできる膜タンパク質のTEM分析に広く適用可能です。

Introduction

生物学的研究には、細胞内およびオルガネラ内の細胞内タンパク質局在化を解決する問題が含まれることがよくあります。免疫蛍光顕微鏡はタンパク質局在化の有用な低分解能のビューを提供し、超解像イメージングにおける最近の進歩は、蛍光タグ付きタンパク質1、2、3の解像度の限界を押し上げている。しかし、電子顕微鏡(EM)は、タンパク質の標識は課題であるが、高解像度の細胞超構造をイメージングするためのゴールドスタンダードのままです。

歴史的に、超構造タンパク質局在化の問題にアプローチするためにいくつかのEM法が使用されてきた。最も一般的に利用されている方法の1つは、抗原特異的一次抗体を使用して目的のタンパク質を検出する免疫電子顕微鏡(IEM)です。EMシグナルは、電子密度の高い粒子と共役する二次抗体の適用により生成され、最も一般的には金金4、5がコロイド状である。あるいは、大根ペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素と結合した抗体は、6,7,8の電子密度の高い沈殿物を製造するために使用することができる。IEM には、事前埋め込みと埋め込み後のラベリングという 2 つの主要なアプローチがあります。事前埋め込みIEMにおいて、抗体は細胞に直接導入され、細胞9、10、11の光固定および透過性化が必要となる。両方のステップは、超構造12、13を損傷する可能性があります。1.4 nmナノゴールドと結合した抗体Fab断片からなるかなり小さい抗体の開発は、非常に穏やかな透過性条件を使用することができます。しかし、ナノゴールドはTEMの下で直接可視化するには小さすぎて、14、15、16を見えるようにするために追加の強化ステップが必要です。埋め込み後IEMでは、固定、脱水、および樹脂17への埋め込みによって完全に処理された細胞の薄い切片に抗体が適用される。このアプローチは浸透化ステップを回避しますが、サンプル調製を通して目的のエピトープを維持することは困難である18,19,20.光固定法に続いて凍結、凍結分断、抗体検出により、エピトープ保存21,22が改善されました。しかしながら、クライオ超ミクロトミーの技術的要件は、細胞内で達成される最適でないコントラストと同様に、23の欠点である。

遺伝的にコードされたタグを使用すると、目的のタンパク質の検出に関連するIEMの多くの困難が排除されます。HRP、フェリチン、リース、ミニソグ、メタロチオーネイン24、25、26、27、28、29、30、31、32を含む様々なタグが利用可能です。これらの各方法には、以前の方法よりも利点がありますが、それぞれが広く使用されるのを妨げる欠点もあります。これらの欠点は、サイトゾル中のHRPの不活性からフェリチンタグの大きなサイズ、ReAsHの光感受性、およびメタロチオネインの細胞染色との相溶性の小さいサイズおよび適合性の欠如まで及ぶ。近年、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ由来のタンパク質が、APEX233,34というEMタグとして設計されている。ペルオキシダーゼとして、APEX2は3,3’ジアミノベンジジン(DAB)の酸化を触媒し、目的タンパク質(25nm未満)33、35から最小の拡散で局所EMコントラストを提供するために四酸化オスミウムと反応する沈殿物を生成することができる。従来のHRPベースの方法とは異なり、APEX2は非常に安定しており、すべてのセルラーコンパートメント33でアクティブなままです。サンプルは、従来のEMサンプル染色法と、周囲の構造33、34、36の良好な可視化を可能にする方法を使用してTEM用に処理することができる。サイズが小さく、安定性と汎用性が高いため、APEX2は大きな可能性を秘めたEMタグとして登場しました。

上で論議したアプローチの多くは、超構造保存、クライオフィクセションおよび低温凍結置換における現在の最新技術と組み合わせることができないか、まだ組み合わせられていない。したがって、正確なタンパク質局在性を決定するために、膜保存や細胞染色の欠如に苦しんでいます。これは、取得できるデータの解決と解釈を必ずしも制限します。高圧凍結(HPF)によるクライオフィケーションは、液体窒素中の試料を高圧(約2,100bar)で急速に凍結し、水性試料の結晶化ではなくガラス化を引き起こし、したがってほぼ天然状態の細胞を37、38、39に保存する。HPFは、凍結置換(FS)、低温(-90°C)のアセトンでの脱水を、四酸化オスミウムや酢酸ウラニルなどの典型的なEM染色剤とインキュベーションと組み合わせた。HPFとFSは、従来の化学固定(アーティファクトにつながる可能性のあるより長いプロセス)や室温または氷上でのアルコール脱水(脂質および糖の抽出につながる可能性がある)に対して明確な利点を提供し、したがって、タンパク質検出のための最良のEMタグと組み合わせることが望ましい。

HPF/FSがAPEX2標識と組み合わされていない理由の1つは、光化学固定がペルオキシダーゼ反応の前提条件であり、DAB反応生成物の拡散を制限していることである。これまでのAPEX2研究では、固定およびペルオキシダーゼ反応は、染色およびアルコール脱水33、36のための伝統的なEM法が続いている。しかし、HPF/FSによる化学的固定に続いて、従来の化学固定とアルコール脱水単独で40を保存する上で明確な利点を提供することが示されている。従来のTEMサンプルに見られる超構造的完全性の喪失は、脱水よりも固定に関連していないように見え、これは通常、室温または氷上でアルコールを使用して行われ、脂質および糖40、41の抽出につながる可能性がある。クライオAPEX法を開発するために、化学固定とペルオキシダーゼ反応、続いてHPFおよびFSが超構造保存の面で最適な結果を生み出すと仮定した。

ここでは、APEX2 タグと cryofixation とフリーズ置換メソッドを組み合わせた cryoAPEX プロトコルを紹介します (図 1)。この簡単なプロトコルは、対象となる APEX2 タグ付けされたタンパク質のトランスフェクション、細胞の化学固定、およびペルオキシダーゼ反応から成ります。HPFとFSは、次いで典型的な樹脂埋め込みと薄い断面化を行います。TEMイメージングは、この方法を用いた超構造の優れた保存を明らかにする。さらに、高分解能細胞内局在化および小胞体(ER)内腔タンパク質の空間分布が観察された。この方法は、電子顕微鏡分析のために細胞内の膜タンパク質局在化の検出に広く有用である。私たちの手では、この方法は、HEK-293T(ヒト胚性腎臓)、HeLa(ヒト子宮頸癌)、Cos7(アフリカの緑のサル腎臓線維芽細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)など、組織培養で成長した様々な細胞株に成功しています。詳細な指示は、HEK-293T細胞を使用して以下に説明します。

Protocol

1. 細胞培養とトランスフェクション 播種HEK-293T細胞は直径60mm以上の組織培養皿に、37°Cおよび5%CO2で細胞培養インキュベーターで60%~90%の合流点に成長する。 トランスフェクション試薬を用いたAPEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドを有するトランスフェクション細胞(材料表を参照)。 トランスフェクション後 12~15時間で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)?…

Representative Results

従来の固定と脱水を用いたcryoAPEX法を用いた超構造保存を比較するために、小胞体膜(ERM;ER膜)ペプチドをAPEX2でタグ付けし、HEK-293T細胞にトランスフェクトした。ERM-APEX2は、ERの細胞質面に局限し、組織化平滑ER(OSER)34、42、43として知られている形態学的に異なる構造にER構造を改造する。OSERの形態は、超構造保存を比較する…

Discussion

ここで提示されるcryoAPEXプロトコルは、細胞環境内の膜タンパク質の局在を特徴付ける堅牢な方法を提供します。遺伝的にコードされた APEX2 タグを使用すると、目的のタンパク質の正確な局在化が実現するだけでなく、クライオフィクセションと低温脱水を使用することで、周囲の細胞の超構造の優れた保存と染色が実現します。これらのアプローチを組み合わせることで、細胞内のコンテ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ここで説明するプロトコルは、Senguptaら、細胞科学ジャーナル、132(6)、jcs222315(2019)48による出版物に由来する。 この研究は、国立衛生研究所のR01GM10092(S.M.へ)とAI081077(R.V.S.)、インディアナ州臨床翻訳科学研究所のCTSI-106564(S.M.へ)、PI4D-209263(S.M.)による感染症・感染症研究所の助成金によって支えられている。

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400
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References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) – mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX – an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).
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