꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화
Summary
기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.
Abstract
전이는 암 관련 죽음의 주요 원인이고 전이성 질병을 가진 환자를 위한 한정된 치료 선택권이 있습니다. 전이성 질병에 대한 더 나은 치료법의 개발을 용이하게 하는 새로운 치료 표적의 식별 및 테스트에는 생체 내 전임상 모델이 필요합니다. 여기에서 입증된 것은 유방암 전이성 식민지화 및 후속 성장을 위한 합성 마우스 모델이다. 전이성 암 세포는 반딧불 루시퍼라제 및 ZsGreen 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터로 안정적으로 변환됩니다. 후보 유전자는 그 때 luciferase/ZsGreen 발현암세포에서 그 후에 세포가 전이성 식민지화 및 성장을 분석하기 위하여 측방 꼬리 정맥을 통해 마우스로 주입됩니다. 생체 내 이미징 장치는 살아있는 동물의 종양 세포의 생물 발광 또는 형광을 측정하여 시간이 지남에 따라 전이성 부담의 변화를 정량화하는 데 사용됩니다. 형광 단백질의 발현은 절편 또는 조직학적 염색없이 실험이 끝날 때 폐에서 전이의 수와 크기를 정량화할 수 있게 한다. 이 접근법은 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 테스트하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 전통적인 꼬리 정맥 전이 분석보다 훨씬 더 많은 정보를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여, 우리는 유방암 세포에 있는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 연관된 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 녹다운이 폐에 있는 감소된 전이성 부담으로 이끌어 내고 이 감소된 부담이 현저하게 손상한 전이성 식민지 및 전이성의 감소된 성장의 결과이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
암은 전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인 남아1 전이 이 죽음의 대부분에 대한 책임이2,3. 그러나, 전이성 식민지및 후속 성장을 통제하는 분자 기계장치의 한정된 이해는 전이성 질병을 위한 효과적인 처리의 발달을 방해했습니다. 새로운 치료 표적의 확인은 후보 유전자의 교란된 발현 또는 기능이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하기 위한 분석법을 필요로 한다. autochthonous 마우스 모델은 장점이 있지만 생성하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들기 때문에 대상 검색보다는 대상 유효성 검사에 더 적합합니다. 후보 유전자가 시험관 내 암세포에서 교란되고 전이성 전위전위에 대한 영향이 생체 내에서 평가되는 이식 모델 시스템은 자가 진단모델보다 비용이 적게 들고 처리량이 높다. 또한, RNAi, CRISPR/CAS9 및 트랜스유전자의 안정한 전달을 위한 바이러스 벡터가 널리 이용가능하여, 암 세포주에서 관심 있는 거의 모든 유전자 또는 유전자를 비교적 쉽게 교란할 수 있다. 이 접근법은 또한 세포를 면역 타협 또는 인간화 된 마우스로 이식함으로써 인간 암 세포주에서 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
생체 내에서 이식된 암세포에 의한 전이 형성을 테스트하는 데 사용되는 두 가지 유형의 실험은 자발적전이성 전이 검정 및 실험전이이다. 자발적 전이분석4,5에서,암세포는 마우스로 주입되고, 원발성 종양을 형성하도록 허용한 다음, 자발적전이 형성 및 후속 성장이 분석된다. 이 모형의 힘은 세포가 전이성 종양을 형성하기 위하여 전이성 프로세스의 모든 단계를 완료해야 한다는 것입니다. 그러나, 많은 암 세포주는 자발적인 전이 모델에서 효율적으로 전이되지 않으며, 원발성 종양 성장에 영향을 미치는 세포의 조작은 전이 분석의 결과를 혼동할 수 있다. 암세포가 순환에 직접 주입되는 실험적 전이 실험은 이러한 함정을 피하기 위해 사용됩니다. 일반적인 실험전이검사는꼬리정맥주사6,7,8(여기서 입증됨), 심내주사9,및 문맥주사(10)를 포함한다.
여기에 제시된 프로토콜의 목적은 연구원이 실시간으로 전이 형성 및 성장을 모니터링할 수 있도록 하는 생체 내 실험 전이 분석실험을 제공할 뿐만 아니라 동일한 마우스의 폐에서 종점 전이 수 및 크기를 정량화하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 전통적인 꼬리 정맥 전이 검소6,7,8은 생체 내 이미징 장치9,11,12,13,14를사용하여 살아있는 동물 이미징과 결합된다. 루시퍼라제와 형광 단백질을 모두 안정적으로 발현하는 종양 세포는 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스내로 주입된 후 생체내 이미징 장치는 시간이 지남에 따라 폐의 전이성 부담의 변화를 측정하는데 사용된다(그림1). 그러나, 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 개별 전이의 크기를 구별하거나 측정할 수 없다. 따라서, 실험의 끝에서, 형광 입체 현미경은 절편 및 조직학 또는 면역 조직화학의 필요없이 폐에서 형광 전이의 크기를 카운트하고 측정하기 위해 사용된다(그림 1). 이 프로토콜은 후보 유전자의 발현 또는 기능을 변경하는 것이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 항체를 차단하는 작은 분자 또는 기능과 같은 잠재적인 치료 화합물도 시험될 수 있습니다.
이 접근법을 설명하기 위하여는, 우리는 먼저 필수적인 복제 인자, 복제 단백질 A3 (RPA3)가 전이성 마우스 유방암 세포에서 쓰러지는 개념 실험의 증명을 수행했습니다. 우리는 RPA3 녹다운 세포로 주입된 마우스가 대조군 세포로 주입된 마우스에 비해 매 시점에서 현저한 전이성 부담을 가지고 있음을 보여준다. 전이 함유 폐의 분석은 이러한 전이성 부담 감소가 전이성 식민지화 및 형성되는 전이의 성장을 크게 감소시킨 결과임을 보여준다. 이 기술을 추가로 설명하기 위하여는, 우리는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 관련 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 노크가 전이성 식민지화 또는 후속 성장을 손상하는지 여부를 시험했습니다. YAP 와 TAZ는 하마 통로의 중요한 하류 이펙터인 두 개의 관련 전사 공동 활성제입니다. 우리15,16 및 그 외는 전이에 YAP와 TAZ를 연루했습니다(17,18,19에서검토), 이 단백질이 좋은 치료 표적이다는 것을 건의합니다. 일관되게, 우리는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스가 전이성 부담을 현저하게 감소시켰음을 발견했습니다. 폐의 분석은 YAP/TAZ 녹다운 세포가 더 적은 전이를 형성하고 양식한 전이가 더 작다는 것을 보여주었습니다. 이 실험은 실험적인 전이 실험이 어떻게 연구원이 전이 형성 및 성장에 있는 후보 유전자의 역할을 신속하고 저렴하게 시험하는 것을 허용하는지 보여줍니다. 그(것)들은 또한 살아있는 동물 화상 진찰의 결합한 사용 및 전체 폐에 있는 전이의 형광 정량화가 전이성 식민지 도중 단계를 더 잘 이해하는 것을 허용하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
메서드의 중요한 단계
주어진 세포주 및 마우스 균주에 대해 주입된 세포수(단계 3)를 최적화하는 것이 중요하며, 이는 실험의 형태및 길이에 크게 영향을 미칠 수 있다. 너무 많은 세포가 주입되거나 전이가 너무 오래 증가하는 경우에, 전이가 평가하기 어려운 유전 조작의 효력을 만드는 계산하기 어려울 지도 모릅니다. 그러나, 너무 적은 세포가 주입되는 경우에, 몇몇 또는 전혀 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 바이러스 감염과 원고의 비판적 독서를 지원에 대한 에밀리 노턴 감사합니다. 우리는 또한 폐에 있는 녹색 전이의 심상 분석에 도움을 위한 폐와 케이트 E. Tubbesing의 심상을 취득하는 것을 도움을 위한 라이언 카나이 에게 감사합니다. 동물 연구 시설 직원의 지원과 이 비디오 작성에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 지원되었다 (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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