Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni
Summary
L’approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.
Abstract
La metastasi è la principale causa di decessi correlati al cancro e ci sono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con malattia metastatica. L’identificazione e il collaudo di nuovi obiettivi terapeutici che faciliteranno lo sviluppo di migliori trattamenti per la malattia metastatica richiede modelli preclinici in vivo. Dimostrata qui è un modello di topo singenico per la soranalisi della colonizzazione metastatica del cancro al seno e la crescita successiva. Le cellule tumorali metastatiche sono tradusse stabilmente con vettori virali che codificano le luciferasi delle lucciole e le proteine verdi. I geni candidati vengono poi manipolati stabilmente nelle cellule tumorali che esprimono luciferasi / sGreen e quindi le cellule vengono iniettate nei topi attraverso la vena della coda laterale per testare la colonizzazione e la crescita metastatica. Un dispositivo di imaging in vivo viene quindi utilizzato per misurare la bioluminescenza o la fluorescenza delle cellule tumorali negli animali viventi per quantificare i cambiamenti nel carico metastatico nel tempo. L’espressione della proteina fluorescente consente di quantificare il numero e le dimensioni delle metastasi nei polmoni alla fine dell’esperimento senza la necessità di sezionare o colorare istologico. Questo approccio offre un modo relativamente rapido e semplice per testare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione e nella crescita metastatica e fornisce molte più informazioni rispetto ai tradizionali saggi di metastasi della vena della coda. Utilizzando questo approccio, mostriamo che il knockdown simultaneo di yes associated protein (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TAz) nelle cellule di cancro al seno porta a una riduzione del carico metastatico nei polmoni e che questo carico ridotto è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente compromessa e di una ridotta crescita delle metastasi.
Introduction
Il cancro rimane la seconda causa di morte in tutto il mondo1 e la metastasi è responsabile della maggior parte di questi decessi2,3. Tuttavia, una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che governano la colonizzazione metastatica e la successiva crescita ha ostacolato lo sviluppo di trattamenti efficaci per la malattia metastatica. L’identificazione di nuovi obiettivi terapeutici richiede un saggio per testare come l’espressione o la funzione perturbata di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Sebbene i modelli di mouse autoctonomi abbiano i loro vantaggi, richiedono molto tempo e sono costosi da generare, il che li rende più adatti per la convalida degli obiettivi piuttosto che per l’individuazione della destinazione. I sistemi modello di trapianto in cui il gene candidato è perturbato nelle cellule tumorali in vitro e quindi gli effetti sul potenziale metastatico sono valutati in vivo, sono meno costosi e una maggiore produttività rispetto ai modelli autoctoni. Inoltre, sono ampiamente disponibili vettori virali per la consegna stabile di RNAi, CRISPR/CAS9 e transgene, il che rende relativamente facile perturbare praticamente qualsiasi gene o gene di interesse in linee cellulari tumorali. Questo approccio può essere utilizzato anche per esaminare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione metastatica e nella crescita delle linee cellulari del cancro umano trapiantando le cellule in topi immunocompromessi o umorizzati.
I due tipi di saggi utilizzati per testare la formazione di metastasi da cellule tumorali trapiantate in vivo sono saggi di metastasi spontanei e saggi di metastasi sperimentali. Nei saggi di metastasi spontanea4,5, le cellule tumorali vengono iniettate nei topi, permesso di formare un tumore primario, e quindi la formazione spontanea di metastasi e la crescita successiva sono formulati. La forza di questo modello è che le cellule devono completare tutte le fasi del processo metastatico al fine di formare tumori metastatici. Tuttavia, molte linee cellulari tumorali non metastatizzano in modo efficiente nei modelli di metastasi spontanee, e qualsiasi manipolazione delle cellule che colpisce la crescita primaria del tumore può confondere i risultati del saggio di metastasi. I saggi sperimentali di metastasi, in cui le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nella circolazione, vengono utilizzati per evitare queste insidie. I più saggi di metastasi sperimentale comuni includono l’iniezione dellavenadella coda6,7,8 (e qui riportata), l’iniezione intracardiaca9e l’iniezione di vena del portale10.
Lo scopo del protocollo qui presentato è quello di fornire un test di metastasi sperimentale in vivo che consente a un ricercatore di monitorare la formazione e la crescita delle metastasi in tempo reale, nonché di quantificare il numero e le dimensioni della metastasi del punto finale nei polmoni dello stesso topo. Per raggiungere questo obiettivo, i tradizionali saggi sperimentali della vena della coda6,7,8 sono combinati con l’imaging animale vivo, utilizzando un dispositivo di imaging in vivo9,11,12,13,14. Le cellule tumorali che esprimono stabilmente sia la luciferasi che una proteina fluorescente vengono iniettate nei topi attraverso la vena laterale della coda e quindi il dispositivo di imaging in vivo viene utilizzato per misurare i cambiamenti nel carico metastatico nei polmoni nel tempo (Figura 1). Tuttavia, il dispositivo di imaging animale vivo in vivo non può distinguere o misurare le dimensioni delle singole metastasi. Così, alla fine dell’esperimento, uno stereomicroscopio fluorescente viene utilizzato per contare il numero e misurare la dimensione delle metastasi fluorescenti nei polmoni senza la necessità di sezionamento e istologia o immunohistochimica (Figura 1). Questo protocollo può essere utilizzato per testare come alterare l’espressione o la funzione di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Possono essere testati anche potenziali composti terapeutici come piccole molecole o anticorpi di blocco delle funzioni.
Per dimostrare questo approccio, abbiamo prima eseguito un esperimento proof of concept in cui il fattore di replicazione essenziale, la proteina di replicazione A3 (RPA3) viene abbattuta nelle cellule metastatiche del cancro al seno del topo. Mostriamo che i topi iniettati con cellule knockdown RPA3 hanno significativamente meno carico metastatico ad ogni punto di tempo rispetto ai topi iniettati con cellule di controllo. L’analisi dei polmoni contenenti metastasi mostra che questo ridotto carico metastatico è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente ridotta e di una crescita compromessa delle metastasi che si formano. Per dimostrare ulteriormente questa tecnica, abbiamo testato se la composizione simultanea di proteine associate AYes (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TA) non compromette la colonizzazione metastatica o la crescita successiva. YAP e TAÀ sono due co-attivatori trascrizionali correlati che sono gli effetti a valle critici del Sentiero Ippopotamo. Abbiamo15,16 e altri hanno implicato YAP e TAz in metastasi (recensito in17,18,19), suggerendo che queste proteine sono buoni obiettivi terapeutici. Coerentemente, abbiamo scoperto che i topi iniettati con cellule knockdown YAP/TAz avevano significativamente ridotto l’onere metastatico. L’analisi dei polmoni ha mostrato che le cellule knockdown YAP/TAz formavano molte meno metastasi e che le metastasi che si formavano erano più piccole. Questi esperimenti dimostrano come i saggi sperimentali di metastasi consentano a un ricercatore di testare in modo rapido ed economico il ruolo di un gene candidato nella formazione e nella crescita delle metastasi. Essi mostrano inoltre come l’uso combinato di imaging animale vivo e quantificazione fluorescente di metastasi in polmoni interi permette al ricercatore di comprendere meglio i passi durante la colonizzazione metastatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche del metodo
È fondamentale ottimizzare il numero di cellule iniettate (passaggio 3) per una determinata linea cellulare e la deformazione del topo in quanto ciò può influenzare notevolmente il numero di metastasi che si formano e la lunghezza dell’esperimento. Se vengono iniettate troppe cellule o le metastasi crescono troppo a lungo, le metastasi possono essere difficili da contare rendendo gli effetti della manipolazione genetica difficili da valutare. Tuttavia, se vengono iniettate …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Emily Norton per aver assistito con le infezioni virali e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche Ryan Kanai per l’aiuto nell’acquisizione di immagini dei polmoni e Kate E. Tubbesing per l’analisi delle immagini delle metastasi verdi nei polmoni. Ringraziamo il personale della struttura di ricerca sugli animali per il loro sostegno e per l’assistenza nella preparazione di questo video. Questo lavoro è stato supportato da un Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
- Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
- Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
- Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
- Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
- Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
- Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
- Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
- Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
- Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
- Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
- Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
- Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
- Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
- Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
- Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
- Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
- Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
- Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
- Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
- Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
- Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
- Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
- Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
- Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
- Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).
