尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化
Summary
記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。
Abstract
転移は癌関連死の主な原因であり、転移性疾患患者の治療選択肢は限られている。転移性疾患のより良い治療法の開発を促進する新規治療標的の同定および検査は、生体内モデルにおける前臨床を必要とする。ここで実証された乳癌転移性コロニー形成とその後の増殖をアッジャーするための同系マウスモデルである。転移性癌細胞は、ホタルルシフェラーゼおよびZsGreenタンパク質をコードするウイルスベクターを安定して形質転換される。候補遺伝子は、ルシフェラーゼ/ZsGreen発現癌細胞で安定して操作され、その後、細胞は転移性コロニー形成および増殖をアッセイするために横尾静脈を介してマウスに注入される。その後、生体内イメージング装置を使用して、生きている動物の腫瘍細胞の生物発光または蛍光を測定し、時間の経過に続く転移性の変化を定量化する。蛍光タンパク質の発現により、断面染色や組織染色を必要とせずに、実験終了時に肺の転移の数と大きさを定量することができます。このアプローチは、転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をテストする比較的迅速かつ容易な方法を提供し、従来の尾静脈転移アッセイよりもはるかに多くの情報を提供する。このアプローチを用いて、乳癌細胞におけるPDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンは、肺における転移性負担の軽減につながり、転移性コロニー形成の著しい低下と転移の増殖の減少の結果であることを示す。
Introduction
癌は世界第2位の死因1であり、転移はこれらの死亡の大部分を担っている2,3.しかし、転移性コロニー形成とその後の増殖を支配する分子機構の理解が限られており、転移性疾患に対する有効な治療法の開発を妨げている。新規治療標的の同定には、候補遺伝子の発現または機能が転移の形成と増殖にどのような影響を与えるかを試験するためのアッセイが必要である。オートクトンマウスモデルには利点がありますが、生成には時間とコストがかかり、ターゲット検出ではなくターゲット検証に適しています。候補遺伝子がインビトロの癌細胞で摂動し、転移電位に及ぼす影響が生体内で評価される移植モデルシステムは、オートクトンモデルよりも安価でスループットが高い。さらに、RNAi、CRISPR/CAS9、およびトランスジーンを安定的に送達するためのウイルスベクターが広く利用可能であり、癌細胞株に存在する遺伝子や遺伝子を比較的容易に摂動させることが容易です。このアプローチは、細胞を免疫不全またはヒト化マウスに移植することによってヒト癌細胞株における転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をアッセイするためにも使用できる。
生体内の移植癌細胞による転移形成を検査するために用いられる2種類のアッセイは、自発的転移アッセイと実験的転移アッセイである。自発的転移アッセイ4,5では、癌細胞をマウスに注入し、原発腫瘍を形成させ、次いで自発的転移形成およびその後の増殖がアッセイされる。このモデルの強みは、転移性腫瘍を形成するために細胞が転移過程のすべてのステップを完了しなければならないことである。しかしながら、多くの癌細胞株は自発的転移モデルでは効率的に転移せず、原発性腫瘍増殖に影響を与える細胞の操作は転移アッセイの結果を混乱させることができる。がん細胞を循環に直接注射する実験的転移アッセイは、これらの落とし穴を避けるために用いられる。一般的な実験的転移アッセイは、尾静脈注射6、7、8(およびここで実証)、心内注射9、および門脈注射10を含む。
ここで提示されるプロトコルの目的は、研究者が転移の形成と成長をリアルタイムで監視し、同じマウスの肺における終点転移数と大きさを定量化することを可能にする生体内実験転移アッセイを提供することです。これを達成するために、従来の実験的な尾静脈転移アッセイ6、7、8は、生体内撮像装置9、11、12、13、14を用いて生体イメージングと組み合わされる。ルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方を安定して発現する腫瘍細胞を横尾静脈を介してマウスに注入し、その後、インビボイメージング装置を使用して、経時の肺の転移性負担の変化を測定する(図1)。しかしながら、生体内生きている動物イメージング装置は、個々の転移の大きさを区別または測定することができない。したがって、実験の終わりに、蛍光立体顕微鏡を使用して、断面化や組織学または免疫組織化学を必要とせずに、肺内の蛍光転移の数をカウントし、サイズを測定する(図1)。このプロトコルは、候補遺伝子の発現または機能を変更することが転移の形成および増殖にどのように影響するかをテストするために使用することができる。小分子または機能遮断抗体などの潜在的な治療化合物も試験することができる。
このアプローチを実証するために、まず、必須の複製因子である複製タンパク質A3(RPA3)が転移性マウス乳癌細胞でノックダウンされる概念実証実験を行いました。我々は、RPA3ノックダウン細胞を注射したマウスは、対照細胞を注射したマウスと比較して、毎回有意に転移性の負担が少ないことを示している。転移を含む肺の分析は、この転移性負担の減少は、転移性コロニー形成を著しく減少させ、形成する転移の増殖を損なった結果であることを示している。さらにこの技術を実証するために、PDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンが転移性コロニー形成またはその後の増殖を損なうかどうかを試験した。YAPとTAZは、カバ経路の重要な下流エフェクターである2つの関連する転写共活性化剤である。我々15、16および他のは転移にYAPおよびTAZを関与させ(17、18、19で検討)、これらのタンパク質が良好な治療標的であることを示唆している。一貫して、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスは転移性負担を有意に軽減していることがわかりました。肺の分析は、YAP/TAZノックダウン細胞が多くのより少ない転移を形成し、形成した転移が小さいことを示した。これらの実験は、実験的な転移アッセイが、転移の形成と増殖における候補遺伝子の役割を迅速かつ安価にテストすることを可能にする方法を実証する。さらに、肺全体の転移の生きた動物イメージングと蛍光定量を組み合わせることで、転移性コロニー形成中の工程をよりよく理解する方法を示す。
Protocol
このプロトコルは、マウスやバイオ危険物の使用を含み、適切な機関安全委員会の承認を必要とします。ここで説明されている生体内の仕事のすべては、アルバニー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。 注: プロトコルの概要については、図1の概略を参照してください。 1. 必要なレトロウイ?…
Representative Results
上記のアプローチを実証するために、重要な複製因子であるRPA3を転移マウス乳腺癌細胞株(4T122)でノックダウンした概念実証実験を行った。このプロトコルは、遺伝子操作の前にルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方で細胞を標識することを記述しているが、RNAiベクターもZsGreenを提供するので、我々は改変されたアプローチを用いた(図2A)。</s…
Discussion
メソッドの重要な手順
これは、形成する転移の数と実験の長さに大きく影響を与えることができるので、特定の細胞株とマウス株のために注入される細胞の数を最適化することが重要です(ステップ3)。あまりにも多くの細胞が注入されたり、転移が長時間増殖したりすると、転移を数え難しくして遺伝子操作の効果を評価することが困難になる可能性があります。しかし、注?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ウイルス感染と原稿の批判的な読書を支援してくれたエミリー・ノートンに感謝します。また、ライアン・カネイは、肺の画像を取得し、ケイト・E・タブベシングが肺の緑色転移の画像解析を支援してくれたことに感謝します。動物研究施設のスタッフのサポートと、このビデオの準備に関する支援に感謝します。この作品は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支援されました。
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
- Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
- Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
- Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
- Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
- Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
- Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
- Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
- Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
- Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
- Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
- Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
- Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
- Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
- Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
- Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
- Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
- Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
- Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
- Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
- Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
- Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
- Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
- Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
- Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
- Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).
Cite This Article
Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).