Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких
Summary
Описанный подход сочетает в себе экспериментальные метастазирование хвостовой вены с in vivo живой изображения животных, чтобы в режиме реального времени мониторинга образования метастазов рака молочной железы и роста в дополнение к количественной метастазировать число и размер в легких.
Abstract
Метастаз является основной причиной смерти, связанной с раком, и существуют ограниченные терапевтические возможности для пациентов с метастатическими заболеваниями. Выявление и тестирование новых терапевтических целей, которые будут способствовать разработке более эффективных методов лечения метастатических заболеваний, требует доклинических моделей in vivo. Демонстрация здесь является сингенной мыши модели для оценки рака молочной железы метастатической колонизации и последующего роста. Метастатические раковые клетки стерливо трансумцируются с вирусными переносчиками, кодирующие светлячок люциферазы и белки SGreen. Кандидат генов затем стабилизированы в люциферазе / SGreen-выражение раковых клеток, а затем клетки вводятся в мышей через боковую вену хвоста, чтобы ассировать метастатическую колонизацию и рост. Устройство in vivo для визуализации используется для измерения биолюминесценции или флуоресценции опухолевых клеток у живых животных для количественной оценки изменений метастатического бремени с течением времени. Выражение флуоресцентного белка позволяет количественно определить количество и размер метастазов в легких в конце эксперимента без необходимости секционирования или гистологического окрашивания. Этот подход предлагает относительно быстрый и простой способ проверить роль генов-кандидатов в метастатической колонизации и роста, и предоставляет гораздо больше информации, чем традиционные анализы метастазов хвостовых вен. Используя этот подход, мы показываем, что одновременное снижение ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного коактиватора с связывающим мотивом PD ‘ (ТАЗ) в раковых клетках молочной железы приводит к снижению метастатического бремени в легких и что это снижение нагрузки является результатом значительно йогтерированной метастатизации и снижения роста метастазов.
Introduction
Рак остается второй ведущей причиной смерти во всем мире1 и метастаз является причиной большинства из этих смертей2,3. Однако ограниченное понимание молекулярных механизмов, регулирующих метастатическую колонизацию и последующий рост, препятствует разработке эффективных методов лечения метастатических заболеваний. Идентификация новых терапевтических целей требует анализа, чтобы проверить, как возмущенное выражение или функция гена кандидата влияет на формирование метастаз и рост метастаза. В то время как автохтонусные модели мыши имеют свои преимущества, они отнимают много времени и дорого генерировать, что делает их более подходящими для целевой проверки, а не целевого обнаружения. Системы модели трансплантации, в которых ген кандидата возмущен в раковых клетках in vitro, а затем воздействие на метастатический потенциал оцениваются in vivo, являются менее дорогостоящими и более высокой пропускной способностью, чем автохтоновые модели. Кроме того, вирусные векторы для стабильной доставки РНК, CRISPR/CAS9 и трансгенов широко доступны, что делает его относительно легко возмущать практически любой ген или гены, представляющие интерес в раковых клеток линий. Этот подход также может быть использован для оценки роли генов-кандидатов в метастатической колонизации и росте раковых клеток человека путем пересадки клеток на ослабленных иммунитетом или гуманизированных мышей.
Два типа анализов, используемых для проверки образования метастазов пересаженные раковые клетки in vivo являются спонтанными метастазами анализы и экспериментальные метастазовые анализы. При спонтанных метастазах анализы4,5, раковые клетки вводятся в мышей, позволило сформировать первичную опухоль, а затем спонтанное образование метастазов и последующего роста анализируются. Сила этой модели заключается в том, что клетки должны завершить все этапы метастатического процесса, чтобы сформировать метастатические опухоли. Тем не менее, многие линии раковых клеток не метастазируют эффективно в спонтанных моделях метастаз, и любые манипуляции клеток, которые влияют на первичный рост опухоли может смутить результаты метастазировать анализ. Экспериментальные метастазные анализы, в которых раковые клетки вводятся непосредственно в обращение, используются, чтобы избежать этих ловушек. Общие экспериментальные метастазовые анализы включают инъекции хвостовойвены 6,7,8 (и продемонстрировали здесь), интракардиальная инъекция9,и портальная инъекциявены 10.
Цель протокола, представленного здесь, заключается в том, чтобы обеспечить экспериментальный метастазный ассса in vivo, который позволяет исследователю отслеживать образование метастазов и рост в режиме реального времени, а также количественно определить количество метастазов и размер ы в легких одной и той же мыши. Для достижения этой цели, традиционные экспериментальные метастазовые хвостовые вены анализы6,7,8 сочетаются с живой изображения животных, используя in vivo изображений устройства9,11,12,13,14. Опухолевые клетки, устойчиво выражающие как люциферазу, так и флуоресцентный белок, вводятся мышам через боковую хвостовую вену, а затем устройство in vivo imaging используется для измерения изменений метастатического бремени в легких с течением времени(рисунок 1). Тем не менее, устройство in vivo live animal image не может различать или измерять размер отдельных метастазов. Таким образом, в конце эксперимента, флуоресцентный стереомикроскоп используется для подсчета числа и измерения размера флуоресцентных метастаз в легких без необходимости секционирования и гистологии или иммуногистохимии (Рисунок 1). Этот протокол может быть использован для проверки того, как изменение экспрессии или функции гена кандидата влияет на формирование метастазирования и рост. Потенциальные терапевтические соединения, такие как небольшие молекулы или функции блокирующие антитела также могут быть проверены.
Чтобы продемонстрировать этот подход, мы впервые выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором основной фактор репликации, репликации белка A3 (RPA3) сбит в метастатических клеток рака молочной железы мыши. Мы показываем, что мыши, вводимые клетками RPA3, имеют значительно меньше метастатического бремени в каждый момент времени по сравнению с мышами, вводимыми контрольными клетками. Анализ метастазов, содержащих легкие, показывает, что это снижение метастатического бремени является результатом значительного снижения метастатического колонизации и нарушения роста метастазов, которые образуются. Чтобы еще больше продемонстрировать этот метод, мы проверили ли одновременно сбить Да связанных белка (YAP) и транскрипционного со-активатора с PD – связывающий мотив (ТАЗ) ухудшает метастатическую колонизацию или последующий рост. YAP и ТАЗ являются двумя связанными транскрипционными со-активаторами, которые являются критическими эффекторами вниз по течению Пути Гиппо. Мы15,16 и другие причастны YAP и ТАЗ в метастазирование (рассмотрено в17,18,19), предполагая, что эти белки являются хорошими терапевтическими целями. Последовательно, мы обнаружили, что мыши, введенные с YAP / TA ‘ нокдаун клетки значительно снизили метастатическое бремя. Анализ легких показал, что клетки яп/ТАЗ образуют гораздо меньше метастазов и что метастазовые метастаза, которые действительно образуются, были меньше. Эти эксперименты демонстрируют, как экспериментальные метастазные анализы позволяют исследователю быстро и недорого проверить роль гена-кандидата в формировании метастазов и росте. Они также показывают, как комбинированное использование живой визуализации животных и флуоресцентная количественная оценка метастазов в целых легких позволяет исследователю лучше понять шаги во время метастатичной колонизации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги метода
Очень важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток (шаг 3) для данной клеточной линии и деформации мыши, поскольку это может значительно повлиять на количество метастаз, которые образуются, и продолжительность эксперимента. Если слишком мног…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эмили Нортон за помощь в борьбе с вирусными инфекциями и критическое чтение рукописи. Мы также благодарим Райана Канаи за помощь в получении изображений легких и Кейт Э. Таббесинг за помощь в анализе изображений зеленых метастазов в легких. Мы благодарим сотрудников научно-исследовательского центра по животноводству за поддержку и помощь в подготовке этого видео. Эта работа была поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присудил JML (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
- Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
- Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
- Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
- Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
- Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
- Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
- Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
- Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
- Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
- Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
- Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
- Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
- Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
- Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
- Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
- Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
- Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
- Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
- Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
- Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
- Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
- Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
- Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
- Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
- Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).
