Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge
Summary
Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.
Abstract
Metastasen sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle und es gibt nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten für Patienten mit metastasierenden Erkrankungen. Die Identifizierung und Erprobung neuartiger therapeutischer Ziele, die die Entwicklung besserer Behandlungen für metastasierende Erkrankungen erleichtern, erfordert präklinische In-vivo-Modelle. Gezeigt wird hier ein syngenes Mausmodell zur Assaying-Metatonisierung von Brustkrebs und anschließendem Wachstum. Metastasierende Krebszellen werden stabil mit viralen Vektoren transduziert, die Glögfeuer-Luziferase und ZsGreen-Proteine kodieren. Kandidatengene werden dann in luziferase/ZsGrün-exezierenden Krebszellen stabil manipuliert und dann werden die Zellen über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert, um metastasierende Besiedlung und Wachstum zu assay. Ein In-vivo-Bildgebungsgerät wird dann verwendet, um die Biolumineszenz oder Fluoreszenz der Tumorzellen bei den lebenden Tieren zu messen, um Veränderungen der metastasierenden Belastung im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Die Expression des fluoreszierenden Proteins ermöglicht es, die Anzahl und Größe der Metastasen in der Lunge am Ende des Experiments zu quantifizieren, ohne dass eine Schnitt- oder histologische Färbung erforderlich ist. Dieser Ansatz bietet eine relativ schnelle und einfache Möglichkeit, die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen, und bietet viel mehr Informationen als herkömmliche Schwanzvenenmetastasasasen. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass der gleichzeitige Knockdown von Yes assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) in Brustkrebszellen zu einer reduzierten metastasierenden Belastung in der Lunge führt und dass diese reduzierte Belastung das Ergebnis einer signifikant beeinträchtigten metastasierenden Kolonisation und eines reduzierten Wachstums von Metastasen ist.
Introduction
Krebs bleibt die zweithäufigste Todesursache weltweit1 und Metastasen sind für die Mehrheit dieser Todesfälle verantwortlich2,3. Ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die die metastasierende Kolonisation und das anschließende Wachstum steuern, hat jedoch die Entwicklung wirksamer Behandlungen für metastasierende Krankheiten behindert. Die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele erfordert einen Test, um zu testen, wie gestörte Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Autochthone Mausmodelle haben zwar ihre Vorteile, sind aber zeitaufwändig und teuer zu generieren, wodurch sie besser für die Zielvalidierung als für die Zielermittlung geeignet sind. Transplantationsmodellsysteme, bei denen das Kandidatengen in vitro in Krebszellen gestört wird und dann Die Auswirkungen auf das metastasierende Potenzial in vivo bewertet werden, sind kostengünstiger und höherer Durchsatz als autochthone Modelle. Darüber hinaus sind virale Vektoren für die stabile Lieferung von RNAi, CRISPR/CAS9 und Transgenen weit verbreitet, was es relativ einfach macht, praktisch jedes Gen oder Gene zu stören, die an einer Krebszelllinie interessiert sind. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Besiedlung und dem Wachstum menschlicher Krebszelllinien zu untersuchen, indem die Zellen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse transplantiert werden.
Die beiden Arten von Assays, die verwendet werden, um die Metastasenbildung durch transplantierte Krebszellen in vivo zu testen, sind spontane Metastasen-Assays und experimentelle Metastasen-Assays. In spontanen Metastasen-Assays4,5werden Krebszellen in Mäuse injiziert, erlaubt, einen Primärtumor zu bilden, und dann werden spontane Metastasenbildung und anschließendes Wachstum untersucht. Die Stärke dieses Modells besteht darin, dass die Zellen alle Schritte des metastasierenden Prozesses ausführen müssen, um metastasierende Tumoren zu bilden. Jedoch, viele Krebszelllinien nicht effizient in spontanen Metastasen-Modelle metastasieren, und jede Manipulation der Zellen, die primäre Tumorwachstum beeinflusst, kann die Ergebnisse der Metastasierung Assay verwirren. Experimentelle Metastasen-Assays, bei denen Krebszellen direkt in den Kreislauf injiziert werden, werden verwendet, um diese Fallstricke zu vermeiden. Häufige experimentelle Metastasen-Assays sind die Schwanzveneninjektion6,7,8 (und hier gezeigt), intrakardiale Injektion9und Portalveneninjektion10.
Der Zweck des hier vorgestellten Protokolls ist es, einen in vivo experimentellen Metastasen-Assay bereitzustellen, der es einem Forscher ermöglicht, die Metastasenbildung und das Wachstum in Echtzeit zu überwachen, sowie die Anzahl und Größe von Endpunktmetastasen in der Lunge derselben Maus zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, werden traditionelle experimentelle Schwanzvenenmetastasen6,7,8 mit Live-Tierbildgebung kombiniert, mit einem in vivo Bildgebungsgerät9,11,12,13,14. Tumorzellen, die sowohl Luziferase als auch ein fluoreszierendes Protein stabil exezieren, werden über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert und dann wird das in vivo Bildgebungsgerät verwendet, um Veränderungen der metastasierenden Belastung in der Lunge im Laufe der Zeit zu messen (Abbildung 1). Das in vivo Live-Tierbildbildgerät kann jedoch die Größe einzelner Metastasen nicht unterscheiden oder messen. So wird am Ende des Experiments ein fluoreszierendes Stereomikroskop verwendet, um die Anzahl zu zählen und die Größe der fluoreszierenden Metastasen in der Lunge zu messen, ohne dass Schnittund und Histologie oder Immunhistochemie erforderlich sind (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu testen, wie die Veränderung der Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Mögliche therapeutische Verbindungen wie kleine Moleküle oder funktionsblockierende Antikörper können ebenfalls getestet werden.
Um diesen Ansatz zu demonstrieren, führten wir zunächst ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem der wesentliche Replikationsfaktor, das Replikationsprotein A3 (RPA3), in metastasierenden Maus-Brustkrebszellen niedergeschlagen wird. Wir zeigen, dass Mäuse, die mit RPA3-Knockdown-Zellen injiziert werden, zu jedem Zeitpunkt eine signifikant geringere metastasierende Belastung aufweisen als Mäuse, die mit Kontrollzellen injiziert werden. Die Analyse der metastasierenden Lunge zeigt, dass diese reduzierte metastasierende Belastung das Ergebnis einer signifikant reduzierten metastasierenden Kolonisation und eines beeinträchtigten Wachstums der metastasierenden Metastasen ist. Um diese Technik weiter zu demonstrieren, haben wir getestet, ob der gleichzeitige Abschlag von Yes-assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) die metastasierende Kolonisation oder das nachfolgende Wachstum beeinträchtigt. YAP und TAZ sind zwei verwandte Transkriptions-Coaktivatoren, die die kritischen downstream-Effektoren des Hippo-Pfads sind. Wir15,16 und andere haben YAP und TAZ in Metastasen verwickelt (rezensiert in17,18,19), was darauf hindeutet, dass diese Proteine gute therapeutische Ziele sind. Konsequenterweise fanden wir heraus, dass Mäuse, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, die metastasierende Belastung signifikant reduziert hatten. Die Analyse der Lunge zeigte, dass die YAP/TAZ-Knockdown-Zellen viel weniger Metastasen bildeten und dass die Metastasen, die sich bildeten, kleiner waren. Diese Experimente zeigen, wie experimentelle Metastasen-Assays es einem Forscher ermöglichen, schnell und kostengünstig die Rolle eines Kandidatengens bei der Metastasenbildung und dem Wachstum zu testen. Sie zeigen ferner, wie der kombinierte Einsatz von Live-Tierbildgebung und fluoreszierender Quantifizierung von Metastasen in ganzen Lungen es dem Forscher ermöglicht, die Schritte während der metastasierenden Besiedlung besser zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte der Methode
Es ist wichtig, die Anzahl der injizierten Zellen (Schritt 3) für eine bestimmte Zelllinie und Mausdehnung zu optimieren, da dies die Anzahl der Metastasen, die sich bilden, und die Länge des Experiments stark beeinflussen kann. Wenn zu viele Zellen injiziert werden oder die Metastasen zu lange wachsen, können die Metastasen schwer zu zählen sein, was die Auswirkungen der genetischen Manipulation schwer einschätzen kann. Wenn jedoch zu wenige Zellen injiziert werden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Emily Norton für die Unterstützung bei Virusinfektionen und die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Ryan Kanai für die Hilfe beim Erfassen von Bildern der Lunge und Kate E. Tubbesing für Hilfe bei der Bildanalyse der grünen Metastasen in der Lunge. Wir danken den Mitarbeitern der Tierforschungseinrichtung für die Unterstützung und unterstützung bei der Erstellung dieses Videos. Diese Arbeit wurde von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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