Dit protocol beschrijft een efficiënte elektroporatiemethode voor de transfection van vier verschillende gastro-intestinale organoïde entiteiten met grotere plasmiden (in de mate van 10 kB). Het kan binnen één dag worden uitgevoerd en heeft geen uitgebreide voorbereiding of speciale, kostenintensieve elektroporatiebuffers nodig.
Elektroporatie is een veel voorkomende methode voor transfection met verschillende soorten moleculen door elektrische permeabilisatie van het plasmamembraan. Met het toenemende gebruik van organoïden als kweekmethode voor primair patiëntmateriaal in de afgelopen jaren zijn efficiënte overdrachtsmethoden van componenten voor genetische manipulatie in dit 3D-kweeksysteem in nood. Vooral voor organoïden hangt de efficiëntie van genetische manipulaties af van een succesvolle transfection. Zo werd dit protocol ontwikkeld om de elektroporatie van organoïden te vergemakkelijken en de universele functionaliteit ervan in verschillende entiteiten te bewijzen. Menselijke colorectale, alvleesklier-, lever- en maagkankerorganoïden werden met succes geëlekporated met kleine en grote plasmiden in vergelijking. Op basis van GFP-coderingsvectoren werd de transfection-efficiëntie bepaald door FACS. Er zijn geen uitgebreide voorbereiding van de cellen of speciale, kostenintensieve elektroporatiebuffers nodig en het protocol kan binnen één dag worden uitgevoerd.
In de afgelopen jaren werd een nieuw 3D-celkweeksysteem ontwikkeld, organoïden genoemd, ontwikkeld voor verschillende normale en kankerweefsel. Organoïden zijn functioneel en morfologisch zeer dicht bij hun weefsel van oorsprong. Ze kunnen worden gegenereerd uit verschillende soorten, zijn gemakkelijk uitbreidbaar, genomisch stabiel en genetisch aanpasbaar, waardoor ze een ideaal modelsysteem voor genetische onderzoeken1,2,3. Genetische engineering technieken zoals de CRISPR (Geclusterd Regelmatig Interspaced Short Palindrmic Repeats)/Cas9 systeem maken diverse manipulaties mogelijk. De selectie van klonen kan worden gerealiseerd door gedefinieerde mediavoorwaarden, bijvoorbeeld door WNT ligand terugtrekking voor APC (Adenomatose Polyposis Coli) knock-out klonen4,5. Als alternatief moeten selectiemarkeringen worden geïntroduceerd door homologe gerichte reparatie van een targetingvector6,7. Doordat er vaak meer dan één plasmid moet worden ingevoerd, wordt een efficiënte transfection een cruciale parameter. Bovendien is een tijdelijke uitdrukking van de Cas9 endonuclease wenselijk om niet-specifieke off-target effecten teverminderen.
Elektroporatie is een relatief eenvoudige methode om cellen te transfectmet DNA, RNA, eiwitten of andere macromoleculen. Door middel van elektrische pulsen wordt het celmembraan doorlatender en veroorzaakt het een verhoogde opname9. In een eerder gepubliceerd elektroporatieprotocol van colonorganoïden werd een efficiëntie van 30 % met een piggy-bac GFP (groen fluorescerend eiwit) dat vector (7,4 kB) uitdrukt, bereikt in een vierdaagse procedure10. Het volgende protocol is ontwikkeld om een efficiënte transfection van kanker of gezonde organoïden met grote plasmiden codering voor single guide RNA (sgRNA) en de Cas9 endonuclease sequentie (bijvoorbeeld px458 als vector met 9.3 kb) te vergemakkelijken. Het hele elektroporratieproces kan binnen één dag worden uitgevoerd, zonder speciale elektroporatiebuffers, en met ten minste vergelijkbare efficiëntietussen verschillende gastro-intestinale organoïden, namelijk pancreaskanaaladenocarcinoma (PDAC), colorectale kanker (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) en maagkanker (GC) organoïden.
Dit protocol geeft gedetailleerde instructies voor een efficiënte, snelle en eenvoudig uit te voeren elektroporatie van verschillende organoïde entiteiten. Naast de gepresenteerde tumororganoïden van PDAC, CRC, CCC en GC, werkt het ook met succes voor organoïden die uit gezond weefsel zijn afgeleid. Het protocol kan binnen één dag worden uitgevoerd. In gepubliceerde organoïde transfection protocollen duurde de hele procedure vier dagen, waaronder twee dagen van preparaten met verschillende soorten teelt media10,21. In ons protocol is geen speciale voorbehandeling vereist. Door te wassen met elektroporatiebuffer vóór elektroporatie werden de antibioticacomponenten van de media uitgewassen en werd een aanpassing van zoutconcentraties voor optimale impedantiewaarden bereikt. Niettemin moeten enkele kritische aspecten in aanmerking worden genomen voor een succesvolle elektroporatie:
Cellen
In het elektroporatieprotocol van Fujii et al.10 wordt aanbevolen organoïden te scheiden van enkele cellen en deze te filteren door middel van een celzeef van 20 μm. In onze handen vertering aan enkele cellen sterk vermindert de overlevingskansen van cellen. Zoals voorgesteld in Merenda et al.21,distantieerden we ook organoïden tot clusters van 10-15 cellen en konden we geen verminderde efficiëntie bepalen in vergelijking met eencellige dissociatie. Na elektroporatie is het een zeer belangrijke stap om het witte schuim te scheiden, zodat er geen aangesloten cellen verloren gaan.
Voor de 2D-celcultuur is aangetoond dat een regeneratietijd na elektroporatie van meer dan 10 min tot 40 min de overlevingskansen en transfection-efficiëntie verhoogt, vooral van grote plasmiden22. In testexperimenten kan hetzelfde worden gedocumenteerd voor organoïden, wat leidt tot een incubatietrap van 40 min na elektroporatie in dit protocol. Om het herstel van de elektroporatie te verhogen, hebben we ze gekweekt met Rho-geassocieerde eiwitkinase (ROCK) remmer Y-27632 gedurende vijf tot zeven dagen23. Op dezelfde manier is de extra suppletie van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3) remmer CHIR99021 bedoeld om enkele cellen te helpen om10te herstellen .
Instellingen
Een van de voordelen van de gebruikte elektroporator is dat de impedantie kan worden gemeten vóór elektroporratie voor optimale omstandigheden. Volgens de fabrikant moeten de impedantiewaarden 30-55 Ω zijn. In onze handen hebben impedantiewaarden van 30-40 Ω een optimale efficiëntie laten zien. In een voorlopig experiment werden verschillende spanningen en pulslengtewaarden van de poringpuls gevarieerd om het optimale aandeel van efficiëntie in overlevingskansen te vinden. Samengevat kunnen we de beschreven waarden van Fujii et al.10 bevestigen in de verschillende entiteiten die hier worden beschreven.
Dna
Het effect van verschillende DNA-hoeveelheden werd getest in voorbereidende experimenten tot 45 μg DNA per monster. Er kunnen geen cytotoxische effecten worden gedetecteerd. Transfection efficiëntie werd verhoogd in een dosis afhankelijke manier met verzadiging > 30 μg. We gebruikten 30 μg per monster in het uiteindelijke protocol, maar het kan natuurlijk worden verhoogd (bijvoorbeeld voor de elektroporatie van meer plasmiden parallel). Daarnaast lijkt de zuiverheid en concentratie van het DNA erg belangrijk. Een concentratie van meer dan 5 μg/μL heeft een optimale transfection-efficiëntie aangetoond.
Zoals verwacht zou de plasmid van 9,3 kB kunnen worden getransfecteerd met een lagere efficiëntie dan de kleinere plasmia van 4,2 kB (zie figuur 4). Het gebruik van nog grotere plasmiden dan 10 kB zal naar verwachting de efficiëntie verder verminderen. Voor toekomstige toepassingen kan het interessant zijn om minicircle DNA als vector te testen, omdat deze gendragers de bacteriële ruggengraat van een plasmid missen waardoor ze kleiner zijn24. Dit moet leiden tot een verbeterde transfection-efficiëntie. Bovendien zou voor CRISPR-gebaseerde manipulaties van organoïden een directe elektroporatie van sgRNAs gebonden aan Cas9 als ribonucleoprotein (RNP) complex een alternatief of toevoeging25kunnen zijn.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke en Max Heiduk voor uitstekende technische assistentie. De financiering werd verstrekt door Deutsche Krebshilfe (nr. 111350 en 70112925), Sander Stiftung (nr. 2014.104.1), Hector Stiftung (nr. M65.2) en de Europese Unie (ERC nr. 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |