Ce protocole décrit une méthode efficace d’électroporation pour la transfection de quatre entités organoïdes gastro-intestinales différentes avec de plus grands plasmides (à la mesure de 10 kB). Il peut être exécuté dans un jour et n’a pas besoin de préparation étendue ou de tampons d’électroporation spéciaux et coûteux.
L’électroporation est une méthode courante pour la transfection avec différents types de molécules par perméabilisation électrique de la membrane plasmatique. Avec l’utilisation croissante des organoïdes comme méthode de culture pour le matériel patient primaire dans les dernières années, des méthodes efficaces de transfert des composants pour le génie génétique dans ce système de culture 3D sont dans le besoin. En particulier pour les organoïdes, l’efficacité des manipulations génétiques dépend d’une transfection réussie. Ainsi, ce protocole a été développé pour faciliter l’électroporation des organoïdes et pour prouver sa fonctionnalité universelle dans différentes entités. Les organoïdes de cancer côlorectal, pancréatique, hépatique et gastrique humain ont été électroporated avec avec avec de petits et grands plasmides en comparaison. Sur la base des vecteurs de codage GFP, l’efficacité de la transfection a été déterminée par LE FACS. Aucune préparation complète des cellules ou des tampons d’électroporation spéciaux et coûteux n’est nécessaire, et le protocole peut être exécuté en un jour.
Ces dernières années, un nouveau système de culture cellulaire 3D, appelé organoïdes, a été développé pour divers tissus normaux et cancéreux. Les organoïdes sont fonctionnellement et morphologiquement très proches de leur tissu d’origine. Ils peuvent être générés à partir de différentes espèces, sont facilement extensibles, génomiquement stables et génétiquement modifiables, ce qui en fait un système modèle idéal pour les recherches génétiques1,2,3. Les techniques de génie génétique comme le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permettent diverses manipulations. La sélection des clones peut être réalisée par des conditions médiatiques définies, par exemple, par wNT ligand retrait pour APC (Adenomatosis Polyposis Coli) clones knock-out4,5. Alternativement, les marqueurs de sélection doivent être introduits par la réparation dirigée homologue d’un vecteur de ciblage6,7. En raison du fait que souvent plus d’un plasmide doit être introduit, une transfection efficace devient un paramètre crucial. En outre, pour réduire les effets hors cible non spécifiques, une expression transitoire de l’endodoucane Cas9 est souhaitable8.
L’électroporation est une méthode relativement simple pour transfect cellules avec de l’ADN, de l’ARN, des protéines ou d’autres macromolécules. Au moyen d’impulsions électriques, la membrane cellulaire devient plus perméable et provoque une augmentation de l’utilisation9. Dans un protocole d’électroporation précédemment édité des organoïdes du côlon une efficacité de 30 % avec un GFP de piggy-bac (protéine fluorescente verte) exprimant le vecteur (7.4 kB) a été atteint dans une procédure de quatre jours10. Le protocole suivant a été développé pour faciliter une transfection efficace des organoïdes cancéreux ou sains avec de grands plasmides codant pour l’ARN de guide simple (sgRNA) et la séquence d’endonucb de Cas9 (par exemple px458 comme vecteur avec 9.3 kb). L’ensemble du processus d’électroporation peut être effectué en un jour, sans tampons d’électroporation spéciaux, et avec au moins des efficacités comparables entre les différents organoïdes gastro-intestinaux, à savoir l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), le cancer colorectal (CRC), le cholangioccinome (CCC) et les organoïdes du cancer gastrique (GC).
Ce protocole donne des instructions détaillées pour une électroporation efficace, rapide et facile à effectuer de différentes entités organoïdes. En plus des organoïdes tumoraux présentés par PDAC, CRC, CCC et GC, il fonctionne avec succès pour les organoïdes dérivés de tissus sains ainsi. Le protocole peut être exécuté dans un délai d’un jour. Dans les protocoles de transfection organoïde publiés, l’ensemble de la procédure a duré quatre jours, y compris deux jours de préparations avec différents types de médias de culture10,21. Dans notre protocole, aucun prétraitement spécial n’est requis. En se lavant avec le tampon d’électroporation avant l’électroporation les composants antibiotiques des médias ont été lavés et un ajustement des concentrations saline pour des valeurs optimales d’impédance a été réalisé. Néanmoins, certains aspects critiques devraient être considérés pour une électroporation réussie :
Cellules
Dans le protocole d’électroporation de Fujii et coll.10, il est recommandé de dissocier les organoïdes à des cellules individuelles et de les filtrer à travers une passoire cellulaire de 20 m. Dans nos mains, la digestion des cellules individuelles diminue fortement la survie des cellules. Comme suggéré dans Merenda et autres21,nous avons également dissocié des organoïdes aux groupes de 10-15 cellules et ne pouvions pas déterminer une efficacité diminuée comparée à la dissociation de cellules simples. Après l’électroporation, il est très important de dissocier la mousse blanche, de sorte qu’aucune cellule attachée ne se perd.
Pour la culture cellulaire 2D, il a été démontré qu’un temps de régénération après l’électroporation de plus de 10 min jusqu’à 40 min augmente la capacité de survie et l’efficacité de transfection en particulier des grands plasmides22. Dans les expériences d’essai, la même chose pourrait être documentée pour les organoïdes, menant à une étape d’incubation de 40 min après électroporation dans ce protocole. Afin d’augmenter la récupération de l’électroporation, nous les avons cultivés avec Rho-associé protéine kinase (ROCK) inhibiteur Y-27632 pendant cinq à sept jours23. De même, la supplémentation supplémentaire de glycogène synthase kinase 3 (GSK3) inhibiteur CHIR99021 est destiné à aider les cellules simples à récupérer10.
Paramètres
L’un des avantages de l’électroporateur utilisé est que l’impédance peut être mesurée avant l’électroporation pour des conditions optimales. Selon le fabricant, les valeurs d’impédance devraient être de 30-55 euros. Dans nos mains, les valeurs d’impédance de 30-40 ont montré des efficacités optimales. Dans une expérience préliminaire, différentes tensions et valeurs de longueur d’impulsion de l’impulsion de poring ont été variées pour trouver la proportion optimale de l’efficacité à la survie. En résumé, nous avons pu confirmer les valeurs décrites de Fujii et coll.10 dans les différentes entités décrites ici.
Adn
L’effet de différentes quantités d’ADN a été testé dans des expériences préliminaires jusqu’à 45 g d’ADN par échantillon. Aucun effet cytotoxique n’a pu être détecté. L’efficacité de la transfection a été augmentée d’une manière dépendante de la dose avec la saturation ‘gt; 30 ‘g. Nous avons donc utilisé 30 g par échantillon dans le protocole final, mais bien sûr il peut être augmenté (par exemple, pour l’électroporation de plus de plasmides en parallèle). En outre, la pureté et la concentration de l’ADN semble être très important. Une concentration supérieure à 5 g/L a montré des efficacités de transfection optimales.
Comme prévu, le plasmide de 9,3 kB pourrait être transfecté avec une efficacité inférieure à celle du plasmide plus petit de 4,2 kB (voir la figure 4). L’utilisation de plasmides encore plus gros que 10 kB devrait diminuer encore l’efficacité. Pour les applications futures, il pourrait être intéressant de tester l’ADN minicercle comme vecteur, puisque ces porteurs de gènes n’ont pas l’épine dorsale bactérienne d’un plasmide qui les rend plus petits24. Cela devrait se traduire par une efficacité de transfection améliorée. En outre, pour les manipulations à base de CRISPR d’organoïdes une électroporation directe de sgRNAs liés à Cas9 comme un complexe de ribonucléoprotéine (RNP) pourrait être une alternative ou l’ajout25.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke et Max Heiduk pour leur excellente assistance technique. Le financement a été fourni par Deutsche Krebshilfe (No 111350 et 70112925), Sander Stiftung (No 2014.104.1), Hector Stiftung (No M65.2) et l’Union européenne (ERC no 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |