このプロトコルは、より大きなプラスミドを有する4つの異なる胃腸オルガノイドエンティティのトランスフェクションのための効率的なエレクトロポレーション法を記述する(10kBの範囲)。それは1日以内に行うことができるし、広範な準備または特別な、費用を要するエレクトロポレーションの緩衝液を必要としない。
エレクトロポレーションは、形質膜の電気透過による分子の種類の異なる種類を持つトランスフェクションのための一般的な方法です。近年、一次患者材料の培養方法としてオルガノイドの使用が増加する中、この3D培養システムにおける遺伝子工学のための成分の効率的な伝達方法が必要とされている。特にオルガノイドの場合、遺伝子操作の効率はトランスフェクションの成功に依存します。したがって、このプロトコルは、オルガノイドのエレクトロポレーションを促進し、異なるエンティティでその普遍的な機能を証明するために開発されました。ヒト大腸、膵臓、肝癌オルガノイドは、比較して小さくて大きなプラスミドで正常にエレクトロポレートされた。GFP符号化ベクトルに基づいて、トランスフェクション効率はFACSによって決定された。細胞の広範な調製または特別な、費用を要するエレクトロポレーションバッファーは必要とされず、プロトコルは1日以内に行うことができる。
近年、オルガノイドと呼ばれた新しい3D細胞培養系が、種々の正常および癌組織に対して開発された。オルガノイドは、機能的および形態学的に起源の組織に非常に近い。それらは、異なる種から生成することができ、容易に拡張可能であり、遺伝的に安定し、遺伝的に変更可能であり、遺伝子調査1、2、3のための理想的なモデルシステムとなる。CRISPR(クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームの繰り返し)/Cas9システムのような遺伝子工学的な技術は、多様な操作を可能にする。クローンの選択は、定義された培地条件、例えば、APC(アデノマトーシスポリポシス・コリ)ノックアウトクローン4、5のWNTリガンド離脱によって実現することができる。あるいは、選択マーカーは、標的ベクトル6、7の相同指向修復によって導入されなければならない。多くの場合、複数のプラスミドを導入する必要があるという事実のために、効率的なトランスフェクションが重要なパラメータになります。さらに、非特異的なオフターゲット効果を低減するために、Cas9エンドヌクレアーゼの一過性発現が望ましい8。
エレクトロポレーションは、DNA、RNA、タンパク質、その他の高分子で細胞をトランスフェクトする比較的簡単な方法です。電気パルスによって、細胞膜はより透過性になり、取り込み増加を引き起こす9.以前に公表された大腸オルガノイドのエレクトロポレーションプロトコルではピギーバクGFP(緑色蛍光タンパク質)発現ベクター(7.4kB)を用いて30%効率で4日間の手順10に達した。以下のプロトコルは、単一ガイドRNA(sgRNA)およびCas9エンドヌクレアーゼ配列(例えば9.3kbのベクターとしてのpx458)をコードする大きなプラスミドを用いる癌性または健康なオルガノイドの効率的なトランスフェクションを促進するために開発されました。電気穿孔プロセス全体は、特別なエレクトロポレーションバッファーなしで、そして異なる胃腸小器官、すなわち膵管腺癌(PDAC)、大腸癌(CRC)、胆管癌(CCC)および胃癌(GC)オルガノイドの間で少なくとも同等の効率で、1日以内に行うことができる。
このプロトコルは、効率的で迅速かつ簡単に異なるオルガノイドエンティティのエレクトロポレーションを行うための詳細な指示を提供します。PDAC、CRC、CCCおよびGCからの提示された腫瘍オルガノイドに加えて、健康な組織に由来するオルガノイドにもうまく働く。プロトコルは 1 日以内に実行できます。公表されたオルガノイドトランスフェクションプロトコルでは、全手順は、異なる種類の栽培培地10、21で2日間の調製を含む4日間続いた。私たちのプロトコルでは、特別な前処理は必要ありません。エレクトロポレーション前にエレクトロポレーションバッファーで洗浄することにより、培地の抗生物質成分を洗い流し、最適なインピーダンス値を求める生理食分濃度の調整を行った。それにもかかわらず、エレクトロポレーションを成功させるためにいくつかの重要な側面を考慮する必要があります。
細胞
Fujii et al.10によるエレクトロポレーションプロトコルでは、オルガノイドを単一細胞に解なじ、20 μm のセルストレーナーを通してそれらをフィルタリングすることが推奨されます。私たちの手で単一の細胞への消化は、細胞の生存性を強く低下させます。メレンダら21で示唆されているように、我々はまた、10-15細胞のクラスターにオルガノイドを解離し、単一細胞解離と比較して効率の低下を決定することができなかった。エレクトロポレーション後、それは付着した細胞が失われないように、白い泡を解結することは非常に重要なステップです。
2D細胞培養では、10分を超える10分を40分以上のエレクトロポレーション後の再生時間が、特に大きなプラスミド22の生存性及びトランスフェクション効率を高めることが示されている。試験実験では、オルガノイドについて同じことが文書化され、このプロトコルでエレクトロポレーション後に40分のインキュベーションステップにつながる。エレクトロポレーションからの回収率を上げるために、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を5~7日間23で培養した。同様に、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)阻害剤CHIR99021の追加補充は、単一細胞が10を回復するのを助けることを意味する。
設定
使用されるエレクトロポレーターの利点の1つは、最適な条件のためにエレクトロポレーションの前にインピーダンスを測定できることです。メーカーによると、インピーダンス値は30~55Ωである必要があります。私たちの手の中で、30-40 Ωのインピーダンス値は最適な効率を示しています。予備実験では、ポーリングパルスの異なる電圧およびパルス長値を変化させ、生存性に対する効率の最適な割合を見つけた。要約すると、ここで説明する異なるエンティティで藤井ら10の記載値を確認することができた。
Dna
異なるDNA量の効果を、サンプルあたり最大45μgのDNAの予備実験で試験した。細胞毒性の影響は検出できませんでした。トランスフェクション効率は、飽和度が30μgの用量依存的な方法で増加した。そこで、最終的なプロトコルではサンプルあたり30μgを使用しましたが、もちろん(例えば、より多くのプラスミドを並列にエレクトロポレーションするため)増加させることができます。さらに、DNAの純度と濃度は非常に重要であると思われます。5 μg/μLを超える濃度は、最適なトランスフェクション効率を示しています。
予想通り、9.3 kBプラスミドは小さい4.2 kBプラスミドよりも低い効率でトランスフェクトされる可能性があります(図4を参照)。10kBよりもさらに大きなプラスミドを使用すると、さらに効率が低下することが予想されます。将来のアプリケーションでは、これらの遺伝子キャリアはプラスミドの細菌骨格を欠き、24を小さくするので、ベクターとしてミニサークルDNAをテストすることは興味深いかもしれません。これにより、トランスフェクション効率が向上するはずです。さらに、オルガノイドのCRISPRベースの操作のために、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体としてCas9に結合したsgRNAの直接エレクトロポレーションは、代替または付加25であり得る。
The authors have nothing to disclose.
ジュリアン・フォグルフ、アン・クリスティン・メイネッケ、マックス・ハイドゥクの優れた技術支援に感謝します。ドイツ・クレブシルフェ(No 111350および70112925)、サンダー・スティフトゥン(No 2014.104.1)、ヘクター・スティフトゥン(No M65.2)、欧州連合(ERC No 639050)が資金を提供しました。
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |