골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석
Summary
여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.
Abstract
메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)은 DNA 샘플의 메틸화 수준에서 상대적 차이를 감지하는 데 사용할 수 있는 간단하고 강력한 기술입니다. 그것은 수완이 많고, 소량의 DNA를 필요로하며, 실습 작업의 약 4-5 시간을 취합니다. 제시된 기술에서, DNA 견본은 대조물로 메틸화되거나 참조 사이트에 DNA를 표적으로 하는 탐사기로 그 때 첫째로 변성됩니다. 혼성화된 DNA는 병렬 반응으로 분리되고, 하나는 결찰만 을 겪고 다른 하나는 메틸화되지 않은 GCGC 서열에서 HhaI 매개 소화에 이어 결찰을 겪습니다. 결과 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭되고 모세관 전기 동아에 의해 분리됩니다. 메틸화 GCGC 사이트는 HhaI에 의해 소화되지 않고 피크 신호를 생성하지만, 메틸화되지 않은 GCGC 사이트는 소화되고 피크 신호가 생성되지 않습니다. 각 샘플의 소화 및 소화되지 않은 버전의 제어 정규화 피크를 비교하면 DNA 샘플의 메틸화 투여 비율이 제공됩니다. 여기서, MSPA는 중간엽 줄기 세포에서 긴 산재핵 원소-1(LINE-1)의 메틸화 상태에 대한 골육종 유래 세포간 소포(EV)의 효과를 검출하는데 사용된다. LINE-1s는 전형적으로 암에 있는 hypomethylation를 겪는 반복적인 DNA 원소이고, 이 수용량에서, biomarker로 봉사할 수 있습니다. 초원심분리는 또한 생물학적 유체로부터 세포외 소포를 분리하는 비용 효율적인 방법으로 사용됩니다(즉, EV고갈린 태아 소 혈청 [FBS]을 준비하고 골육종 컨디셔닝 매체[차동 원심분리])에서 EV를 분리하는 경우). 메틸화 분석을 위해 맞춤형 LINE-1 프로브는 LINE-1 프로모터 서열과 7개의 제어 부위에서 3개의 메틸화 부위를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 LINE-1 메틸화 분석을 위한 MSPA의 사용을 보여주고 초원심분리에 의한 EV 고갈 된 FBS의 제조를 설명합니다.
Introduction
DNA 메틸화는 인간 세포에서 발생하는 주요 후생유전학적 변형이다. DNA 메틸화는 CpG 디뉴클레오티드에서 시토신 잔기에 메틸 기의 연계를 지칭한다. 이러한 디뉴클레오티드는 일반적으로 유전자1의5′ 영역에서 클러스터 (CpG 제도)에서 발견된다. 정상 세포에서는, 이 디뉴클레오티드의 대부분은 DNA 전사를 허용하는 미수정 상태에서 존재합니다. 덧붙여, 많은 암은 과민성 CpG 섬 및 전사체침묵과연관됩니다 2, 특히 종양 억제유전자에서, 이는 차례로암3의각종 특징에 기여합니다.
다른 한편으로는, 긴 산재핵 원소-1 (LINE-1s 또는 L1s)는 일반적으로 CpG 제도에서 메틸화의 상부를 가지고 반복적이고, 전염가능한 DNA 원소이다. LINE-1의 메틸화는 전좌를 방지하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 여러 유형의 암에서 LINE-1은 저혈압이 되어 활성화 및 후속 역류 매개 염색체 불안정성을초래합니다 4. LINE-1은 인간 게놈5의거의 17%를 차지하며, 그 메틸화 상태는 글로벌 게놈 메틸화 수준6의지표로서 작용할 수 있다. 글로벌 LINE-1 하부메틸화는 종양 표현형7에대한 세포의 전이보다 선행하는 것으로 간주된다; 그러므로, 그것은 초기 암 개시를 위한 잠재적인 마커로 약속을 보유합니다.
현재, 열화상 분석, 메틸화 특이적 PCR, 마이크로어레이 및 크로마틴면역침전1을포함하는 메틸화 분석을 위한 몇 가지 방법이 있다. 차세대 염기서열 분석의 사용은 또한 DNA 메틸화의 검출에 게놈 전체 접근을 통합하는 가능하게 했습니다. 이러한 방법의 대부분은 비설피테 처리 된 DNA에 의존, 있는 미수정 시토신우라실로 변환되고 메틸화 된 시토신은 변경되지 않은 상태로 유지됩니다. 그러나, 비설피티 처리 된 DNA로 작업하는 것은 우라실로 의 미수정 시토신의 불완전한 변환, 서열의 편향 된 증폭 및 시퀀싱 오류8과같은 몇 가지 함정을 가지고 있다.
메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)에서, 2개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브는 메틸화에 민감한 제한 효소 HhaI 9에대한 제한 부위(GCGC)를 함유하는 DNA 서열을 표적으로 한다. 프로브가 DNA에 혼성화된 후, 각 샘플은 2세트로 나뉩니다. 첫 번째 세트의 프로브는 결찰을 거치고, 두 번째 세트의 프로브는 결찰을 거쳐, 하아I-매개 소화는 미수정 CGCG 부위에서 수행된다. 샘플의 두 세트는 PCR에 의해 증폭되고, 제품은 모세관 전기 동공에 의해 분리됩니다. 미수정 사이트의 프로브는 HhaI에 의해 소화되며 PCR 중에 증폭되지 않아 피크 신호가 생성되지 않습니다. 대조적으로, 메틸화된 부위의 프로브는 소화로부터 보호되고, 따라서 PCR 동안 증폭되어, 이어서 피크신호(10)를생성한다.
MSPA는 대체 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 먼저, 낮은 양의 DNA(50-100 ng)를 필요로 하며 포르말린 고정 파라핀 임베디드샘플(10)으로부터DNA의분석에 적합하다. 그것은 bisulfite 처리된 DNA를 요구하지 않습니다; 사실, 이런 식으로 수정되는 DNA에는 적합하지 않습니다. 많은 견본이 동시에 분석될 수 있고, MSPA 프로브는 다중 유전자 또는 순서를 동시에 표적으로 하도록 디자인될 수 있습니다. 부가적으로, 프로브는 HhaI 제한 부위가 CpG 제도10의전형적인 서열에 대응하기 때문에 메틸화된 DNA에 대해 특이적이고 민감하다.
본 연구는 지방 조직 유래 중간 엽 줄기 세포에서 LINE-1 메틸화에 골육종 (OS)에서 파생 된 세포 외 소포 (EV)의 효과를 조사했다 (AT-MSCs; 그림 1). EV는 대부분의 세포 모형에 의해 분비되는 나노 규모, 막 결합한 소포입니다. 그(것)들은 부모 세포11,12에게서단백질, 지질, mRNA, microRNA 및 추가 분자를 전송합니다. 전기자동차는 세포간 통신을 중재하고 여러 병리생리학적 조건에서 중요한 역할을 한다13,14. 최근 연구에 따르면 암 유래 전기자동차가 활성 LINE-1을 수용자세포(15)로옮길 수 있는 것으로 나타났다. HOS-143B 세포주에서 EV가 다른 유전적 효과16이외에, MSCs에서 LINE-1의 메틸화 상태를 변경할 수 있다는 것이 일찍 보고되었다.
EV 격리를 위한 세포를 성장시킬 때, 성장 배지에 EV 고갈된 태아 소 혈청[FBS]을 사용하는 것이 중요하다, FBS 유래 전기 자동차는 다른 소스로부터 전기자동차를 방해하고 결과를 방해할 수 있기 때문에17,18. 초원심분리는 FBS에서 전기자동차를 고갈시키는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그것은 초여과 및 상용 EV 고갈 FBS19와같은 대안에 비해 상대적으로 간단하고 비용 효율적인 절차이다. 여기서, 프로토콜은 또한 초원심분리에 의해 EV 고갈된 FBS를 준비하는 방법을 보여줍니다.
이 문서에서는 OS 세포주에서 EV를 격리하는 것부터 OS-EV 처리 된 MSCs에서 LINE-1의 메틸화 분석에 이르기까지 전술 한 기술에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 MSPA가 특정 유전 요소의 메틸화 상태를 감지하고 정량화하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. LINE-1은 여기서 초점이 되었지만, 프로브는 다양한 유전자 및 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 또한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있는 프로브 믹스 목록이 늘어나고 있습니다. MSPA는 바이설피테변환(10)을필요로 하지 않는 DNA 메틸화 분석을 위한 간단하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 헬싱키 대학 프로젝트 기금 (WBS490302, WBS73714112) 헬싱키 대학 병원 주립 대학 수준의 건강 연구를위한 자금 (Y1014SUL05, TYH2016130), 핀란드 – 노르웨이 의학 재단, 셀마및 셀마에 의해 지원되었다 마자 리사 실란더 기금 (미네르바 재단). 우리는 수정 된 MSPA 프로토콜을 제공하고 관련 기술 지원을 위해 월터 파비치에게 감사드립니다. 비디오 제작을 도와주신 티무 마살린(헬싱키 대학교)에게 감사드립니다.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
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