LINE-1 Metyleringsanalyse i mesenchymale stamceller behandlet med osteosarkom-avledet ekstracellulære vesikler
Summary
Beskrevet her er bruk av en metyleringsspesifikk probeforsterkningsmetode for å analysere metyleringsnivåer av LINE-1-elementer i mesenchymale stamceller behandlet med osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugering, en populær prosedyre for å skille ekstracellulære vesikler fra føtal storfe serum, er også demonstrert.
Abstract
Metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) er en enkel og robust teknikk som kan brukes til å oppdage relative forskjeller i metyleringsnivåer av DNA-prøver. Det er ressurssterk, krever små mengder DNA, og tar rundt 4-5 t praktisk arbeid. I den presenterte teknikken blir DNA-prøver først denaturert og deretter hybridisert til sonder som retter seg mot DNA på enten metylerte eller referansesteder som en kontroll. Hybridisert DNA er delt inn i parallelle reaksjoner, en gjennomgår bare ligation og den andre gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på unmethylated GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmentene forsterkes av PCR og skilles av kapillær elektroforese. Metylerte GCGC-nettsteder fordøyes ikke av HhaI og produserer toppsignaler, mens umetylerte GCGC-nettsteder fordøyes og ingen toppsignaler genereres. Sammenligning av de kontrollnormaliserte toppene av fordøyd og ufordøyd versjoner av hver prøve gir metylering dosering forholdet mellom en DNA-prøve. Her brukes MSPA til å oppdage effekten av osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler (EV-er) på metyleringsstatusen til lange interspersed kjernefysiske element-1 (LINE-1) i mesenchymale stamceller. LINE-1s er repeterende DNA-elementer som vanligvis gjennomgår hypometylering i kreft, og i denne kapasiteten kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugering brukes også som en kostnadseffektiv metode for å skille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved utarbeidelse av EV-utarmet fosterstorfeserum [FBS] og isolere EV-er fra osteosarkomkondisjonerte medier [differensial sentrifugering]). For metyleringsanalyse er tilpassede LINE-1-sonder utformet for å målrette tre metyleringssteder i LINE-1-promotersekvensen og syv kontrollsteder. Denne protokollen demonstrerer bruk av MSPA for LINE-1 metyleringsanalyse og beskriver utarbeidelsen av EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.
Introduction
DNA metylering er en stor epigenetisk modifikasjon som forekommer i menneskelige celler. DNA-metylering refererer til koblingen av metylgrupper til cytosinrester i CpG dinukleotider. Slike dinukleotider finnes vanligvis i klynger (CpG-øyer) i 5′-regionen av gener1. I normale celler finnes de fleste av disse dinukleotider i en umetylert tilstand, noe som tillater DNA-transkripsjon. Forresten, mange kreftformer er forbundet med hypermethylated CpG øyer og transkripsjonomic deaktivering2, spesielt i tumor suppressor gener, som igjen bidrar til ulike kjennetegn på kreft3.
På den annen side er lange ispedd kjernefysiske elementer-1 (LINE-1s eller L1s) repeterende, transposable DNA-elementer som normalt har høye nivåer av metylering på CpG-øyene. Metylering av LINE-1 forhindrer translokasjon og bidrar til å opprettholde genomintegriteten. I flere typer kreft er LINE-1 hypomethylated, noe som resulterer i aktivering og påfølgende retrotransposition-mediert kromosomustabilitet4. LINE-1 står for nesten 17% av det menneskelige genomet5,og metyleringsstatusen kan tjene som en indikator på globale genomiske metyleringsnivåer6. Global LINE-1 hypometylering anses å gå forut for overgangen av celler til en tumor fenotype7; Derfor holder det løfte som en potensiell markør for tidlig kreft utbrudd.
For tiden er det flere metoder for metyleringsanalyse, inkludert pyrosequencing, metyleringsspesifikk PCR, mikroarrayer og kromatinimmunnedbør1. Bruken av neste generasjons sekvensering har også gjort det mulig å innlemme genomomfattende tilnærminger til påvisning av DNA-metylering. Mange av disse metodene er avhengige av bisulfittbehandlet DNA, hvor uformede cytosiner omdannes til uracil og metylerte cytosiner forblir uendret. Men, arbeider med bisulfitt behandlet DNA har flere fallgruver, for eksempel ufullstendige konverteringer av unmethylated cytosines til uracil, partisk forsterkning av sekvenser, og sekvensering feil8.
I metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) retter sonder bestående av to oligonucleotides DNA-sekvenser som inneholder et begrensningssted (GCGC) for det metyleringsfølsomme restriksjonsenzymet HhaI9. Etter at sondene hybridiserer til DNA, er hver prøve delt inn i to sett. Sonder i det første settet gjennomgår ligation, mens sonder i det andre settet gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på umetylerte CGCG-steder. Begge settene med prøver forsterkes deretter av PCR, og produktene er adskilt av kapillær elektroforese. Sonder på umetylerte steder fordøyes av HhaI og forsterkes ikke under PCR, noe som resulterer i ingen toppsignaler. Derimot er sonder på metylerte steder beskyttet mot fordøyelsen og forsterkes derfor under PCR, og genererer deretter toppsignaler10.
MSPA har flere fordeler fremfor alternative metoder. For det første krever det en lav mengde DNA (50–100 ng) og er godt egnet for analyse av DNA fra formalin-faste parafininnebygde prøver10. Det krever ikke bisulfittbehandlet DNA; faktisk er det uegnet for DNA som er modifisert på denne måten. Mange prøver kan analyseres samtidig, og MSPA-sonder kan utformes slik at de målretter mot flere gener eller sekvenser samtidig. I tillegg er sondene spesifikke og følsomme for metylert DNA da HhaI-begrensningsstedet tilsvarer en sekvens som er typisk for CpG-øyene10.
Denne studien undersøkte effekten av osteosarkom (OS)-avledet ekstracellulære vesikler (EV- er) på LINE-1-metylering i fettvevsavledede mesenchymale stamceller (AT-MSCer; Figur 1). EV-er er nanoskala, membranbundne vesikler utskilt av de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA og flere molekyler fra overordnede celler11,12. Ev-er medierer intercellulær kommunikasjon og spiller viktige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En fersk studie viste at kreftavledede EV-er kan overføre aktive LINE-1 til mottakerceller15. Det har blitt rapportert tidligere at EV fra HOS-143B cellelinjen kan endre metyleringstatus for LINE-1 i MSCer, i tillegg til andre genetiske effekter16.
Når voksende celler for EV isolasjon, er det viktig å bruke EV-utarmet føtal storfe serum [FBS] i vekstmediet, siden FBS-avledede EV-er kan forstyrre EV fra andre kilder og hemme resultatene17,18. Ultracentrifugering er en av de vanligste metodene for å tømme EV-er fra FBS. Det er en relativt enkel og kostnadseffektiv prosedyre sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommersiell EV-utarmet FBS19. Her demonstrerer protokollen også hvordan man forbereder EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for de nevnte teknikkene, fra isolering av EV-er fra en OS-cellelinje til metyleringsanalyse av LINE-1 i OS-EV-behandlede MCer (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien illustrerer hvordan MSPA kan brukes til å oppdage og kvantifisere metyleringsstatusen til et bestemt genetisk element. LINE-1 var fokusher, men sondene kan utformes for å målrette en rekke gener og sekvenser. Videre er det en voksende liste over sondeblandinger tilgjengelig for ulike applikasjoner. MSPA er en enkel og robust teknikk for DNA metylering analyse som ikke krever bisulfitt konvertering10. Den fullstendige prosedyren fra prøveforberedelse til dataanalyse tar rundt 2 da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Helsinki prosjektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetssykehus Statlig finansiering for universitetsnivå helseforskning (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-Norsk Medisinsk Foundation, og Selma og Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for å ha gitt den modifiserte MSPA-protokollen og for relatert teknisk støtte. Vi er takknemlige til Teemu Masalin (Universitetet i Helsinki) for å hjelpe oss med videoproduksjon.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
