Summary

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.

Abstract

نحن وصف تقنيه لوضع العلامات إلى الوراء من الخلايا العصبية الحركية في دروفيبيلا. نستخدم صبغه زيتية ذائبه بالزيت ونقدم قطره صغيره إلى اعداد الشرائح الجنينية بواسطة الحاقن المجهري. يمكن بعد ذلك تسميه كل الخلايا العصبية الحركية التي يتم الاتصال بها بواسطة القطيرات بسرعة. يتم تسميه الخلايا العصبية الحركية الفردية بشكل مستمر ، مما يتيح التفاصيل الهيكلية الدقيقة ليتم تصورها بوضوح. النظر إلى ان الاصباغ محبه للدهون تاتي في ألوان مختلفه ، وتقنيه يوفر أيضا وسيله للحصول علي الخلايا العصبية المجاورة المسمية في متعدد ألوان. التالي فان تقنيه التتبع هذه مفيده لدراسة نشاه الخلايا العصبية والاتصال المتشابك في نظام الخلايا العصبية الحركية من دروفويلا.

Introduction

يوفر نظام الخلايا العصبية الجنينية للمحركات نموذجا تجريبيا قويا لتحليل أليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. نظام الخلايا العصبية الحركية قابل للتقنيات البيوكيميائية والجينية والتصويرية والكهربية. باستخدام التقنيات ، يمكن اجراء التلاعب الجيني والتحليلات الوظيفية علي مستوي الخلايا العصبية أحاديه المحرك2،4،5،6.

خلال التطور المبكر للجهاز العصبي ، والانفجارات العصبية الانقسام وتوليد عدد كبير من الخلايا العصبية والعصبية. وقد تم التحقيق سابقا في العلاقة المكانية بين الفصل والتعريف الجيني للتعبيرات العصبية في التفاصيل7،8،9. في حاله نظام الخلايا العصبية الحركية ، تمت دراسة تشكيل الوصلة العصبية العضلية الجنينية (nmj) علي نطاق واسع باستخدام aCC (خليه الزاوية الاماميه) ، RP2 (الجمبري الخام 2) ، والخلايا العصبية RP5 موتور2،10. علي سبيل المثال ، عندما تشكل الخلايا العصبية الحركية RP5 تقاطع متشابك الوليدة ، يتم مزج filدستور قبل متشابك وبعد متشابك11،12،13. مثل هذه الاتصالات الخلوية المباشرة أمر حيوي للبدء في تشكيل NMJ. علي عكس ما نعرفه عن فروع العصب المحيطيه ، معرفتنا كيف المحرك تشعبات بدء الاتصال متشابك داخل الاجهزه العصبية الخاصة لا تزال بدائية.

في هذا التقرير ، نقدم تقنيه تسمح بوضع العلامات الارتجاعية للخلايا العصبية الحركية في الاجنه عن طريق تقديم الاصباغ المضادة للدهون بواسطة الماصات المجهرية. هذه التقنية تمكننا من تتبع الخلايا العصبية الحركية 38 العصب كل من عضلات جدار الجسم 30 في الجزء هيمي في 15 ح بعد وضع البيض (AEL)14. باستخدام هذه التقنية ، وقد حققت مجموعتنا بدقه العديد من المكاسب من وظيفة/فقدان الوظيفة الاليلات15،16،17. وقد كشفنا مؤخرا أليات الجزيئية التي تدفع بدء الاتصال تغصن المحرك وأظهرت ان التفاعل Dscam1-قفص-باك يعرف موقع النمو تغصن في الخلايا العصبية الحركية aCC17. بشكل عام ، هذه التقنية قابله للتكيف مع التحليل الظاهري لأي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في السلالات البرية أو المتحولة ، مما يعزز قدرتنا علي توفير رؤى جديده في التصميم الوظيفي للجهاز العصبي دروفويلا .

Protocol

1-المعدات واللوازم مواد لجمع الاجنه وتدريب البالغين علي وضع البيض اعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 mL وفتح فتحه ثقب في الغطاء لتعيين فلتر شبكه مع المسام من 100 μm (جدول المواد) في ما بين الأنبوب والغطاء.ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصافي الخلية مع المسام من 100 μm (…

Representative Results

ويظهر صوره تمثيليه لل aCC و RP3 الخلايا العصبية الحركية في الشكل 3ج لإظهار وسم متعدد ألوان من الخلايا العصبية الحركية في 15 ح AEL. المتحولات الخاصة بهم هي ثابته إلى حد كبير بين الاجنه. ويظهر نمط تلطيخ التي تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة لمكافحه التناسل باللون الرماد?…

Discussion

استخدام الوسم صبغ لدراسة المورفولوجية العصبية لديها العديد من المزايا علي تقنيات الخلايا الوراثية وسم. يمكن لتقنية وضع العلامات صبغ تقليل مقدار الوقت اللازم لوضع العلامات والتصوير من مورفولوجيس من الخلايا العصبية الحركية. عمليه وضع العلامات صبغ سريع جدا لأنه ياخذ اقل من 2 ح وتمكننا من تح…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر كامياما علي التعليقات علي المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 NS107558 (إلى M.I. ، K.B. ، و دي).

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

References

  1. Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
  2. Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
  3. Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
  4. Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
  5. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
  6. Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
  7. Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  9. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
  10. Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
  11. Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
  12. Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
  13. Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
  14. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
  15. Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
  16. Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
  17. Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  19. . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
  20. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
  21. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
  22. Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
  23. Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
  24. Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).

Play Video

Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

View Video