Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles
Summary
Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.
Abstract
Nous décrivons une technique pour l’étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans Drosophila. Nous utilisons un colorant lipophile dissous à l’huile et livrons une petite gouttelette à une préparation de filet embryonnaire par un micro-injecteur. Chaque neurone moteur dont la membrane est contactée par la gouttelette peut alors être rapidement étiqueté. Les neurones moteurs individuels sont continuellement étiquetés, ce qui permet de visualiser clairement les détails structuraux fins. Étant donné que les colorants lipophiles viennent dans différentes couleurs, la technique fournit également un moyen d’obtenir des neurones adjacents étiquetés en multicolore. Cette technique de traçage est donc utile pour étudier la morphogénèse neuronale et la connectivité synaptique dans le système de neurones moteurs de Drosophila.
Introduction
Le système de neurones moteurs embryonnaires de Drosophila offre un modèle expérimental puissant pour analyser les mécanismes sous-jacents au développement du système nerveux central (SNC)1,2,3. Le système de neurones moteurs est favorable aux techniques biochimiques, génétiques, d’imagerie et d’électrophysiologie. En utilisant les techniques, les manipulations génétiques et les analyses fonctionnelles peuvent être effectuées au niveau des neurones moteurs uniques2,4,5,6.
Au début du développement du système nerveux, les neuroblastes se divisent et génèrent un grand nombre de glies et de neurones. La relation spatiotemporale entre la délamination et le profil d’expression génique des neuroblastes a déjà été étudiée en détail7,8,9. Dans le cas du système de neurones moteurs, la formation de la jonction neuromusculaire embryonnaire (NMJ) a été largement étudiée en utilisant l’aCC (cellule d’angle antérieure), RP2 (crevette brute 2), et RP5 neurones moteurs2,10. Par exemple, lorsque le neurone moteur RP5 forme une jonction synaptique naissante, la filopodia pré-synaptique et post-synaptique se mêle11,12,13. Une telle communication cellulaire directe est essentielle pour initier la formation nMJ. Contrairement à ce que nous savons sur les branches nerveuses périphériques, notre connaissance de la façon dont les dendrites motrices initier la connectivité synaptique au sein du SNC est encore primitive.
Dans ce rapport, nous présentons une technique qui permet l’étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans les embryons au moyen de la livraison micropipette-négociée des colorants lipophiles. Cette technique nous permet de retracer les 38 neurones moteurs qui intériorisent chacun des 30 muscles de la paroi du corps dans un segment d’hémi à 15 h après la ponte (AEL)14. En utilisant cette technique, notre groupe a étudié à fond de nombreux gains de fonction/perte de fonction alleles15,16,17. Nous avons récemment démêlé les mécanismes moléculaires qui conduisent l’initiation de la connectivité de dendrite moteur et démontré qu’une interaction Dscam1-Dock-Pak définit le site de la croissance dendrite dans le neurone moteur aCC17. En général, cette technique est adaptable pour l’analyse phénotypique de tous les neurones moteurs embryonnaires de type sauvage ou souches mutantes, ce qui améliore notre capacité à fournir de nouvelles informations sur la conception fonctionnelle du système nerveux Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de l’étiquetage des colorants pour l’étude de la morphologie neuronale présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d’étiquetage génétique des cellules. La technique d’étiquetage des colorants peut réduire au minimum le temps nécessaire à l’étiquetage et à l’imagerie des morphologies des neurones moteurs. Le processus d’étiquetage des colorants est assez rapide car il faut moins de 2 h et nous permet de définir le contour des projections neuronales. Comme alternative, on peut visual…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Kamiyama pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 NS107558 (à M.I., K.B., et D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
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