Summary

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。

Abstract

ショウジョウバアラにおける運動ニューロンの逆行標識の手法について説明する。油溶存親油性染料を使用し、マイクロインジェクターによる胚性フィレット製剤に小さな液滴を送出します。膜が液滴によって接触する各運動ニューロンは、その後、迅速に標識することができる。個々の運動ニューロンは連続的に標識され、細かい構造の細部を明確に視覚化することを可能にする。親油性染料は様々な色で来ることを考えると、この技術はまた、多色で標識された隣接するニューロンを得るための手段を提供する。したがって、このトレース技術は、ショウジョウバアラの運動ニューロン系における神経形態形成およびシナプス接続性を研究するのに有用である。

Introduction

ショウジョウバチの胚性運動ニューロンシステムは、中枢神経系(CNS)1、2、3の発達の基礎となるメカニズムを分析するための強力な実験モデルを提供する。運動ニューロンシステムは、生化学的、遺伝的、イメージング、および電気生理学的技術に適しています。技術を用いて、遺伝子操作および機能解析は、単一運動ニューロン2、4、5、6のレベルで行うことができる。

神経系の初期の発達の間に, 神経芽細胞が分裂し、グリアとニューロンの多数を生成します。.神経芽細胞の剥離と遺伝子発現プロファイルとの間の時空間的関係は、以前に詳細に7、8、9で検討されている。運動ニューロン系の場合、胚神経筋接合部(NMJ)の形成は、aCC(前コーナーセル)、RP2(生エビ2)、およびRP5運動ニューロン2、10を用いて広く研究されている。例えば、RP5運動ニューロンが新生シナプス接合部を形成する場合、シナプス前およびシナプス後フィロポディアは11、12、13と混在する。このような直接的な細胞通信は、NMJ形成を開始するために不可欠である。末梢神経枝について私たちが知っていることとは対照的に、モーターデンドライトがCNS内でシナプス接続を開始する方法についての私たちの知識はまだ原始的です。

本報告では、親油性色素のマイクロピペット媒介送を用いて胚における運動ニューロンの逆行標識を可能にする技術を提示する。この技術により、産卵後15時間で30個の体壁筋肉のそれぞれを15時間でヘミセグメントにインジェインする38個の運動ニューロンをトレースすることができます(AEL)14.この技術を用いることで、当社のグループは多数の機能獲得/機能喪失アレス15、16、17を徹底的調査しました。我々は最近、運動デンドライト接続の開始を駆動する分子機構を解明し、Dscam1-Dock-Pak相互作用がaCC運動ニューロン17における樹状突起伸の部位を定義することを実証した。一般に、この技術は、野生型または変異型株における任意の胚性運動ニューロンの表現型解析に適応可能であり、ショウジョウバエ神経系の機能設計に関する新しい洞察を提供する能力を高める。

Protocol

1. 機器と消耗品 胚を収集し、卵を産むために大人を訓練するための材料 50 mLのチューブを切断し、キャップに穴を開けて切断して、チューブとキャップの間に100μm(材料テーブル)の細孔を持つメッシュフィルタを設定して、濾過装置を準備します。注:あるいは、100μm(材料表)の細孔を有する細胞ストレーナーは、胚採取の濾過工程に使用することが?…

Representative Results

aCCおよびRP3運動ニューロンの代表的な画像を図3Cに示し、15時間AELにおける運動ニューロンの多色標識を示す。彼らの樹状の形態は、胚間の大部分が不変である。抗HRP抗体で得られた染色パターンを灰色で示す。DiOまたはDiDの小さな液滴をそれぞれ筋肉1または6/7のNMJに沈着させた。図4は、目的の表現型を定量的に測定する能力を示す?…

Discussion

神経形態を研究するための色素標識の使用は、遺伝的細胞標識技術よりもいくつかの利点を有する。色素標識技術は、運動ニューロンの形態を標識およびイメージングするために必要な時間を最小限に抑えることができます。色素標識プロセスは2時間未満で、神経突起の輪郭を定義できるので非常に高速です。あるいは、aCCで酵母GAL4転写因子を発現するGAL4線を選択し、上流活性化配列(UAS)21…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

神山研究室の皆様に、原稿に関するご意見をお寄せいただき、ありがとうございます。この作品は、NIH R01 NS107558(M.I.、K.B.、およびD.K.)によってサポートされました。

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

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Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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