גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון
Summary
הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג’וג’וגייט הומוגני.
Abstract
הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה כדי להכניס חומצות אמינו לא טבעיות (כטב”מים) לתוך חלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות או יש גישה ליחידות חלבון. להפסיק דיכוי קודון, במיוחד דיכוי codon ענבר, התגלה כשיטה הפופולרית ביותר להציג גנטית UAAs בעמדות מוגדרות. מתודולוגיה זו מיושמת בזאת על הכנת חלבון נשא המכיל UAA מחסה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. ידית תגובתית זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי להשתיל באופן ספציפי ויעיל אוליגוסכריד hapten סינתטי כדי לספק חיסון גליקוקוג’וג’גייט הומוגני. הפרוטוקול מוגבל לסינתזה של גליקוקוגייטים ביחס חלבון 1:1 פחמימות/נשא, אך ניתן לחוות זוגות רבים של קבוצות תפקודיות ביו-לוגוניות. הומוגניות חיסון Glycocococonjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא, ובכך, סיפוק יותר ויותר תובעני יותר המלצות הסוכנות הרגולטורית סמים, קריטריון אשר לא נענה על ידי אסטרטגיות התייחדות קלאסיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את המבנה של החיסון ההתייחדות בפועל, מה שמוליך כלים לטיפול ביחסים בין מבנה לחיסונים.
Introduction
חיסוני גליקוקו-קו-גייט הם מרכיבים חיוניים של ארסנל החיסון הזמין לטיפול מונע במחלות זיהומיות. הם בטוחים, נסבלים היטב ויעילים בקבוצת גיל רחבה כולל תינוקות צעירים. הם מספקים את ההגנה האופטימלית מפני זיהומים הנגרמת על ידי חיידקים ממוססים כמו מנינגוקוקוס, פנאומוקקוס או שפעת המופילוס סוג b1. חיסוני גליקוקוקוג’וג’גייט עשויים מפוליסכרידים חיידקיים מטוהרים הקוביות של חיידקים או אוליגוסכרידים סינתטיים המחקים את הפוליסכרידיםהמבוטאים עלפני השטח 2 , המקושרים באופן קובלנטי לחלבון מוביל. הנוכחות של חלבון נשא חיוני כדי לקדם תגובות חיסוניות הומוריסטיות מגן מכוון נגד הקובע האנטיגני שהביע אנטיגנים פחמימות3. מלבד בחירה קפדנית וייצור של אנטיגן פחמימות, התכונות ידועות להפעיל השפעה על היעילות של חיסון גליקוקונג’וגייט הם: טבעו של חלבון המוביל, הכימיה ההתייחדות (כולל אופי ואורך המקשר אם נעשה שימוש), או יחס saccharide / חלבון3. מן הסתם, התנוחות שבהן ה-saccharide מודבק לחלבון, כמו גם מספר נקודות הקישוריות רלוונטיות לחיסונים. עד כה, שני פרמטרים אלה כמעט ולא נחקרו כי הכנת גליקוקוגייטים נשאר בעיקר אמפירי. הסינתזה שלהם מסתמכת בדרך כלל על השימוש בפונקציות חומצה קרבוקסילית או קארבוקסילית של, בהתאמה, ליזאין או אספרטית / גלוטמית חומצה בצד שרשרת שאריות הנוכחי על רצף חלבון המוביל. זה מוביל לא לתערובת הטרוגנית של גליקוקו-ג’וגייט.
משחק על תגובתיות, נגישות או התפלגות של שאריות חומצת אמינו בחלבון יוצר גליקוקוגטים מוגדרים יותר כי הם אמינים יותר לתעד את ההשפעה של קישוריות saccharide / חלבון4. צעד קדימה לקראת מטרה זו ניתן להשיג על ידי יישום טכנולוגיית צימוד גליקן חלבון, תהליך רקומביננטי המאפשר ייצור של חיסונים גליקוגט מבוקר במפעלי תאים5,6. עם זאת, גליקוסילציה מתרחשת באופן בלעדי במשקעים אספראג’ין בתוך D / EXNYS / T sequons (לפיה X הוא כל מתוך 20 חומצות אמינו טבעיות), לא קיים באופן טבעי על חלבוני המוביל.
אתר מוטגנזה סלקטיבית ובמיוחד התאגדות של ציסטאין כדי לנצל את תגובתיותם מאוד סלקטיבית מופיעהכאלטרנטיבה 7,8. ייצור חלבוני נשא המשלבים כטב”מים ברצף שלהם יכול להציע גמישות רבה עוד יותר להכנת חיסון גליקו-conjugate הומוגני. יותר מ 100 כטב”מים פותחו ושילבו עוד יותר חלבוניםשונים 9,10. רבים מהם מכילים פונקציות bioorthogonal משמש בדרך כלל לבצע שינוייםתרגום פוסט 11 או להשתיל בדיקותביופיזיות 12 או תרופות 13 אבל שהם ידיות אידיאליות להתייחדות נוספת עם אנטיגנים פחמימות. דוגמאות מוצלחות כבר טענו על ידי ביוטכנולוגיה14 באמצעות סינתזת חלבון ללאתאים 15 אבל הכנת חיסונים גליקוגייט על פי אסטרטגיה זו עדיין מחכה להיות פופולרי.
יישום של אסטרטגיית vivo לייצור של חלבון נשא מוטציה צריך מכונות תרגום שונה הכולל codon ספציפי, tRNA זיהוי קודון סינתזה אמינואציל-tRNA (aaRS) אשר במיוחד מקטע את העברת UAA על tRNA (איור 1)16. דיכוי הענבר pyrrolysine להפסיק קודון היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשלב UAA, במיוחד propargyl-ליסין (PrK)17. האחרון יכול בתורו להגיב עם הפטנים פחמימות פונקציונליאזידו לספק מוגדר באופן מלא, גליקוגטים הומוגניים. בכתב היד הנוכחי אנו מתארים כיצד לסנתז את propargyl-L-ליסין, UAA נושא ידית alkyne, איך לשלב אותו לתוך חלבון היעד במהלך התרגום שלה בחיידק ולבסוף איך לבצע התייחדות בין החלבון שונה hapten נושא פונקציה אזיד באמצעות כימיה לחץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenesis באתר היא אסטרטגיה פשוטה לשלב חומצות אמינו ספציפיות בעמדה מוגדרת של חלבון אשר נשאר בקושי בשימוש במטרה להכין חיסונים גליקונג’וגייט7,8,14. מוטגנזה קלאסית המבוססת על 20 גישת חומצות אמינו טבעיות יעילה מאוד מאחר שלא נדרש שינוי במכונות התרג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. מודה בהכרת תודה על התמיכה הכספית של La Région Pays de la Loire (תוכנית פארי Scientifique “BioSynProt”), במיוחד מלגת דוקטורט ל-T.V. אנו גם מכירים ד”ר רוברט B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, טולוז, צרפת) עבור ייעוץ טכני יקר שלו.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging–Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
