백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트
Summary
유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.
Abstract
유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산 (UAA)을 단백질에 도입하여 특성을 수정하거나 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나 단백질 컨쥬게이트에 액세스 할 수있는 강력한 도구입니다. 스톱 코돈 억제, 특히 앰버 코돈 억제는 정의된 위치에서 UAA를 유전적으로 도입하는 가장 인기있는 방법으로 부상했습니다. 본명에서 생물요르토곤 기능성 군을 수용하는 UAA를 함유하는 담체 단백질의 제조에 적용된다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 1:1 탄수화물 hapten/반송파 단백질 비율에서 글리코콘주게이트의 합성으로 제한되지만 수많은 바이오트호고날 기능성 군으로 만만치 않습니다. 글리코코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하기 위한 중요한 기준이며, 이로 인해 점점 더 까다로운 약물 규제 기관의 권고, 고전적인 융합 전략에 의해 충족되지 않은 기준을 충족시다. 더욱이, 이 프로토콜은 실제 컨쥬게이트 백신의 구조를 미세하게 조정하여 구조-면역원성 관계를 해결하는 도구를 제공할 수 있게 한다.
Introduction
글리코콘주게이트 백신은 전염병의 예방 치료에 사용할 수 있는 백신 무기고의 필수 요소입니다. 그들은 젊은 유아를 포함하여 광범위한 연령 집단에서 안전하고, 잘 용납되고 능률적입니다. 그들은 수막구균, 폐렴구균 또는 혈우병 인플루엔자 형 b1과같은 캡슐화된 박테리아에 의한 감염에 대한 최적의 방어를 제공한다. 글리코코콘주게이트 백신은 담체 단백질에 공동으로 연결되는 이러한 표면 발현 다당류2를모방한 박테리아 또는 합성 올리고당류의 캡슐을 형성하는 정제된 세균다당류로 만들어집니다. 담체 단백질의 존재는 탄수화물 항원3에의해 표현된 항원 결정제에 대하여 지시된 보호적인 유머 면역 반응을 승진시키기 위하여 필수적이다 3. 탄수화물 항원의 신중한 선택 및 생산 외에도, 글리코콘주게이트 백신의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려진 특징은 담체 단백질의 성질, 융합 화학(사용되는 경우 링커의 성질 및 길이 포함), 또는 당캐라이드/단백질 비3이다. 명백하게, 사카라이드가 단백질에 접합되는 위치뿐만 아니라 연결점의 수는 면역원성에 관련이 있습니다. 현재까지, 이 두 매개 변수는 글리코콘주게이트의 준비가 주로 경험적으로 남아 있기 때문에 거의 연구되지 않았습니다. 그들의 합성은 일반적으로 담체 단백질 서열에 존재하는 리신 또는 아스파르트/글루타믹 산 측 사슬 잔류물의 아민 또는 카복실산 기능의 사용에 의존한다. 이것은 단일하지만 글리코콘주게이트의 이질적인 혼합물로 이어집니다.
단백질내 아미노산 잔류물의 반응성, 접근성 또는 분포에 재생하면 saccharide/protein 연결4의효과를 문서화하는 데 더 신뢰할 수 있는 보다 정의된 글리코콘주게이트가 발생합니다. 이러한 목표를 향한 한 걸음 앞으로 단백질 글리칸 커플링 기술, 세포 공장에서 제어글리코콘주게이트 백신의 생산을 허용하는 재조합 공정5,6. 그러나, 글리코실레이션은 전적으로 D/EXNYS/T 세쿤 내의 아스파라진 잔류물에서 일어난다(X는 20가지 천연 아미노산 중 하나임), 담체 단백질에 자연적으로 존재하지 않는다.
사이트 선택적 돌연변이 발생 및 특히 시스테인의 편입이 고도로 선택적 반응성을 악용하는 대안7,8로나타난다. 그들의 순서에 UAA를 통합하는 담체 단백질의 생산은 균일한 글리코콘주게이트 백신 준비를 위한 더 많은 융통성을 제공할 수 있습니다. 100개 이상의 UAA가 개발되어 다양한 단백질9,10에추가로 통합되었다. 그들 중 많은 사람들이 일반적으로 포스트 번역 수정을 수행하거나 생체 물리학 프로브(12 또는 약13)를 이식하는 데 사용되는 생물 ororthogonal 기능을 포함하지만 탄수화물 항원과의 추가 연상을위한 이상적인 핸들입니다. 성공적인 예는 세포 없는 단백질 합성을 사용하여 생명공학14에 의해 주장되었습니다15 그러나 이 전략에 따라 글리코콘주게이트 백신의 준비는 아직도 대중화되기를 기다립니다.
돌연변이 된 담체 단백질의 생산을 위한 생체 내 전략의 적용은 tRNA(도 1)16에 UAA의 전송을 구체적으로 촉매하는 특정 코돈, 코돈 및 아미노 아필 -tRNA 신디사이저 (aaRS)를 인식하는 tRNA를 포함하는 변형 된 번역 기계를 필요로한다( 도1) 16. pyrrolysine 앰버 스톱 코돈 억제는 UAA, 특히 propargyl-lysine (PrK)17을통합하는 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 후자는 아지도 기능성 탄수화물 햅텐과 반응하여 완전히 정의된 균일한 글리코코콘쥬게이트를 제공할 수 있습니다. 본 원고에서는 알킨 핸들을 운반하는 UAA인 propargyl-L-lysine을 합성하는 방법, 박테리아에서 번역하는 동안 표적 단백질에 통합하는 방법, 마지막으로 수정된 단백질과 클릭 화학을 사용하여 아지드 기능을 운반하는 햅텐 사이의 연상을 수행하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현장 지향 돌연변이 발생은 글리코콘주게이트 백신7,8,14를준비하는 것을 목표로 거의 사용되지 않는 단백질의 정의된 위치에 특정 아미노산을 통합하는 간단한 전략이다. 20가지 천연 아미노산 접근법에 기초한 고전적인 돌연변이 발생은 번역 기계의 수정이 필요하지 않으므로 매우 효율적입니다. 시스테인 돌연변이는 일반?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. 감사라 레지온 지불 드 라 루아르 (Pari Scientifique 프로그램 “BioSynProt”), 특히 T.V.에 박사 펠로우십에서 재정 지원을 인정합니다. 우리는 또한 그의 소중한 기술 적 조언에 대한 박사 로버트 B. 쿼스트 (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, 툴루즈, 프랑스)를 인정합니다.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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