Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen
Summary
Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.
Abstract
Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri (UAA) proteinlerin özelliklerini değiştirmek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için tanıtmak için güçlü bir araçtır. Stop kodon bastırma, özellikle kehribar kodon bastırma, genetik olarak tanımlanmış pozisyonlarda BA’ları tanıtmak için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran bir UAA içeren bir taşıyıcı protein hazırlanması için uygulanır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Protokol 1:1 karbonhidrat hapten/taşıyıcı protein oranında glikokonjugates sentezi ile sınırlıdır ancak biorthogonal fonksiyonel grupların çok sayıda çiftleri için münasiptir. Glycococonjugate aşı homojenliği tam fizyo-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir, bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu ilaç düzenleyici kurum önerileri tatmin, klasik konjugasyon stratejileri ile karşılanmayan bir kriter. Ayrıca, bu protokol, yapı-immünojenite ilişkilerine yönelik araçlar ortaya çıkararak, gerçek eşleç aşının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır.
Introduction
Glikokonjugate aşıları, bulaşıcı hastalıkların profilaktik tedavisinde mevcut olan aşı cephaneliğinin temel unsurlarıdır. Onlar güvenli, iyi tolere ve genç bebekler de dahil olmak üzere geniş bir yaş grubunda verimli. Meningokok, pnömokok veya Haemophilus influenzae tip b1gibi kapsüllü bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlara karşı en iyi savunmayı sağlarlar. Glycococonjugate aşılar bakteri kapsülleri oluşturan saflaştırılmış bakteriyel polisakkaritler veya bu yüzey ifade li polisakkaritler taklit sentetik oligosakkaritler yapılır2, kovalent bir taşıyıcı protein ebağlı. Bir taşıyıcı protein varlığı karbonhidrat antijenleri tarafından ifade antijenik determinant karşı yönlendirilen koruyucu humoral bağışıklık yanıtları teşvik etmek esastır3. Karbonhidrat antijeninin dikkatli bir seçimi ve üretimi dışında, glikokonjugate aşısının etkinliği üzerinde etkili olduğu bilinen özellikler şunlardır: taşıyıcı proteinin doğası, konjugasyon kimyası (kullanılırsa bağlayıcının doğası ve uzunluğu dahil) veya sakkarit/protein oranı3. Açıkçası, sakkarit proteine konjuge pozisyonları yanı sıra bağlantı noktalarının sayısı immünjenite için ilgilidir. Glikokonjugates hazırlanması büyük ölçüde ampirik kalır, çünkü bugüne kadar, bu iki parametre pek çalışılmıştır. Sentezleri genellikle taşıyıcı protein dizisinde bulunan lizin veya aspartik/glutamik asit yan zincir kalıntılarının amin veya karboksilik asit fonksiyonlarının kullanımına dayanır. Bu tek bir değil, glikokonjugates heterojen bir karışıma yol açar.
Proteindeki amino asit kalıntılarının reaktivitesi, erişilebilirliği veya dağılımı üzerinde oynamak, sakkarit/protein bağlantısının etkisini belgelemek için daha güvenilir olan daha tanımlı glikokonjugates’e yol açar4. Bu hedefe doğru bir adım protein glikan kaplin teknolojisi, hücre fabrikalarında kontrollü glikokonkonjugate aşıların üretimine olanak sağlayan bir rekombinant süreci uygulayarak elde edilebilir5,6. Ancak, glikozilasyon sadece D /EXNYS/T sequons içinde bir asparagin kalıntısı yer alır (x herhangi bir olduğu gibi 20 doğal amino asitler, doğal taşıyıcı proteinler üzerinde mevcut değildir.
Site seçici mutagenez ve sistein özellikle dahil onların yüksek ve seçici reaktivite yararlanmak için alternatif olarak görünür7,8. Kendi sıralarına UAA’ları içeren taşıyıcı proteinlerin üretimi homojen glikokonleklek aşı hazırlanması için daha fazla esneklik sunabilir. 100’den fazla UAA geliştirilmişve daha çeşitli proteinler9,10dahil edilmiştir. Birçoğu genellikle post translational modifikasyonlar11 veya aşılamak için kullanılan biyoortogonal fonksiyonlar içerir12 veya ilaçlar13 ama karbonhidrat antijenleri ile daha fazla konjugasyon için ideal kolları vardır. Başarılı örnekler Biotech14 tarafından hücresiz protein sentezi15 kullanılarak iddia edilmiştir ancak bu stratejiye göre glikokonjugate aşıların hazırlanması hala popüler hale gelmesini beklemaktadır.
Mutasyona uğramış taşıyıcı protein üretimi için in vivo stratejisinin uygulanması belirli bir kodon içeren değiştirilmiş bir çeviri makine ihtiyacı, kodonu tanıyan bir tRNA ve özellikle tRNA üzerinde UAA transferi katalizler bir aminoasil-tRNA synthetase (aaRS) (Şekil 1)16. Pyrrolysine kehribar stop kodon bastırma uaa dahil etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir, özellikle propargyl-lizin (PrK)17. İkincisi sırayla tam tanımlanmış, homojen glycococonjugates sağlamak için azido fonksiyonel karbonhidrat haptens ile reaksiyona olabilir. Bu el yazmasında, alkin sapı taşıyan bir UAA olan propargyl-L-lizinin nasıl sentezleneceğini, bir bakterinin çevirisi sırasında hedef proteine nasıl dahil edilebildiğini ve son olarak da modifiye edilmiş protein ile tıklama kimyası kullanan bir azit fonksiyonu taşıyan hapten arasında çekimin nasıl yapılacağını anlatıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Site yönelimli mutagenez ancak glikokonjugate aşıları hazırlamak amacıyla kullanılan kalır bir protein tanımlı bir konumda belirli amino asitler dahil etmek için basit bir stratejidir7,8,14. 20 doğal amino asit yaklaşımına dayalı klasik mutagenez, çeviri makinelerinde herhangi bir değişiklik gerektirmediğinden son derece etkilidir. Sistein mutasyonları genellikle daha doğrudan ya da iki adımda benzersiz ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. minnetle La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Programı “BioSynProt”), özellikle t.V. bir doktora bursu mali destek kabul eder. Biz de Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Fransa) onun değerli teknik tavsiyeler için kabul.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging–Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
