세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

Summary

이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

Abstract

합성 세포의 건설을위한 상향식 조립 방법은 세포를 모방 한 환경에서 세포 과정을 격리하고 조사하기위한 효과적인 도구입니다. 더욱이, 세포 없는 발현 시스템의 발달은 합성 생물학을 활용하는 통제된 방식으로 단백질 생산, 전사 및 번역 과정(DNA→RNA→단백질)을 재구성하는 능력을 입증하였다. 여기에서 우리는 강력한 세균 용해물의 생산을 포함하여 세포 자유 발현 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고, 합성 세포를 형성하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 지질 기지를 둔 거대한 unilamellar 소포 (GUV) (즉, 안정한 리포솜) 안쪽에 이 용해물을 캡슐화합니다. 이 프로토콜은 활성 세균 용해물의 생산을 포함하는 합성 세포의 성분을 제조하는 방법을 설명하고, 이어서 수중 오일 에멀젼 전달 방법에 기초하여 합성 세포의 상세한 단계별 제조를 기술한다. 이들은 단백질의 다른 모형을 생산하기 위한 높은 다양성으로 간단하고 적당한 방법으로 합성 세포의 수백만의 생산을 촉진합니다. 얻어진 합성 세포는 고립된 환경에서 단백질/RNA 생산 및 활동을 조사하기 위하여, 지시된 진화에서, 또한 바디 안쪽에 치료 단백질의 온디맨드 생산을 위한 통제된 약 납품 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.

Introduction

합성 세포는 인공 세포와 같은 입자로서, 유전자 코드^1,,2,,3에기초하여 단백질을 분열, 포름, 합성하는 능력과 같은 살아있는 세포의 하나 또는 다중 기능을 모방한다. 무세포 단백질 합성 (CFPS) 시스템을 둘러싸는 합성 세포는 DNA 템플릿의 변경 에 따라 다양한 단백질과 RNA 서열을 생산하는 능력으로 인해 높은 모듈성을 가지고 있습니다. 단백질 생산의 현재 접근법에 대한 매력적인 대안을 제시하는 CFPS 시스템은 세포 용해물, 정제 성분 또는 합성 성분을 기반으로 하며 리보솜, RNA 폴리머라제, 아미노산 및 에너지 원(예를 들어, 3-인산성산염 및 아데닌^5,6,7,8,트리포스페이트)과 같은 단백질 합성에 필요한 모든 전사 및 번역 기계를^4,포함합니다.⁹ 지질 소포 내부의 CFPS 시스템의 캡슐화는 살아있는 세포^(10)에의존하지 않고 단백질의 간단하고 효율적인 생산을 가능하게한다. 더욱이, 이 플랫폼은 천연 세포 내부의 분해될 수 있는 펩타이드의 합성을 허용하고, 살아있는 세포에 독성이 있는 단백질의 생산을 허용하며, 비천연 아미노산^11,,12로단백질을 수정한다. 합성 세포는 진화적 관점에서 세포 생명을 가능하게 하는 데 필요한 최소한의 세포 성분을 조사하는 연구 목적으로 모델로 사용되어 왔다^1,,13. 합성 세포는 또한 유전 회로를 구축하고 구현하는 데 사용되었으며 지시 된 진화^{14,,15,,16을위한}모델로 사용되었습니다. 다른 연구는 당뇨병 환자에서 베타 세포와 같은 손상된 천연 세포를 대체하는 것을 목표로 천연 세포의 생물학적 활성을 모방하는 합성 세포의 능력에 초점을 맞추고^{있다 17.} 더욱이, 다양한 치료 단백질을 생산하는 합성 세포를 캡슐화하는 이러한 CFPS의 능력은 임상 용법^18에통합될 수 있는 잠재력을 보여준다.

여기서 우리는 지질 소포에 캡슐화된 CFPS 시스템에 기초한 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 생산을 위한 상향식 실험실 스케일프로토콜(그림 1)을기술한다. 이는 생체내 치료 단백질 약물의 현장 생산을 위한 신규한 약물 전달 시스템으로서 합성 세포 플랫폼의 잠재적 사용을 보여준다^19. 이전 연구는 CFPS 반응및 세포 리세이트 제제 과정의 최적화를^{조사한 4,,8,,20.} 더욱이, 미유체 및 중합체 계^,물방울 안정화 방법^21,22,,23,리포좀 의 지질 조성물^24,25,26과 같은 세포 크기의 리포좀 제제에 여러 기술이 적용되었다.^,, 제시된 프로토콜에서, 합성 세포는 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하여 제조되고 캡슐화 과정은 저온(&4°C)^{5,,10,,24,,27,,28에서}수행된다. 이러한 온화한 조건은 분자 기계, 즉 리보솜 및 단백질^{27,,29,,30의}생체 기능 적 무결성을 유지하는 데 유리한 것으로 밝혀졌다. 입자의 지질 조성물은 콜레스테롤과 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)으로 구성된다. 첫 번째는 모든 포유류 세포막에서 발견되며 멤브레인의 안정성, 강성 및 투과성 감소에 필수적이며, 후자는 포유류 인지질 조성물^11,,13을모방한다. 세포 전사 및 번역 분자 기계는 BL21 (DE3) 대장균 (대장균) 균주에서 추출되며, 이는 pAR1219 플라스미드로 변형되어 T7 RNA 폴리머라제와 함께 변형되어 CFPS 효능 및 단백질 합성을 증가시킵니다. 이 시스템은 생체외 및 생체내^19,,31의분자량으로 진단 및 치료 단백질을 생산하는 데 사용되었습니다. 다음 프로토콜은 합성 세포 시스템의 생산을 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 본질적으로 단백질 합성과 관련된 광범위한 근본적인 문제를 해결할 수 있으며 약물 전달 응용 분야에도 활용될 수 있다.

Protocol

참고: 완전한 합성 세포의 생산 프로토콜의 그림은 그림 1에제시되어 있습니다. 사용자의 필요에 따라, 프로토콜의 단백질 발현(섹션 3.2) 및 합성 세포 형성(섹션 4) 부분도 독립적으로 수행될 수 있다(일부 적응). 1. S30-T7 용해의 준비 줄무늬 플레이트는 50 μg/mL ampicillin으로 보충된 LB-한천 플레이트상에서 pAR1219 플라스미드를 발현하는 T7 RNA …

Representative Results

우리는 지질 소포 내부의 BL21 대장균에 기초한 S30-T7 CFPS 시스템을 캡슐화하여 합성 세포의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 도 2에각 단계의 이미지를 포함하는 준비 과정에 대한 개략적 설명이 제시된다. 합성 세포 전처리 과정의 성공은 각 단계의 적절한 성능에 의존하고 상이한 파라미터에 의해 영향을 미친다. 프로토콜은 특정 단백질의 생산을 수용하도록 조정?…

Discussion

이 프로토콜은 다량의 단백질 생산 합성 세포를 생산하기 위한 간단하고 저렴한 방법을 소개합니다. 활성 세포의 수율은 몇 가지 중요한 단계에 중점을 둔 프로토콜의 신중하고 정확한 실행에 달려 있습니다. 이 방법의 분해 제제 섹션에서, 세균 분해에 충분한 양의 단백질을 달성하기 위해 세포 가포하기 전에 적절한 박테리아 밀도에 도달하는 것이 필수적이다. 둘째, 용해 과정은 단백질 활성을…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.