Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis
Summary
Diese Arbeit beschreibt Protokolle für die Herstellung von magnetischen Nanopartikeln, seine Beschichtung mit SiO2, gefolgt von seiner Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und seiner Konjugation mit Deferoxamin unter Verwendung eines Succinylmoiety als Linker. Eine tiefe strukturelle Charakterisierungsbeschreibung und ein Aufnahmebakterientest mit Y. enterocolitica für alle Zwischen-Nanopartikel und das endliche Konjugat werden ebenfalls ausführlich beschrieben.
Abstract
In der vorliegenden Arbeit werden die Synthese von magnetischen Nanopartikeln, ihre Beschichtung mit SiO2, gefolgt von ihrer Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und ihre Konjugation mit Deferoxamin, einem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor, mit einem Succinyl-Moiety als Linker beschrieben.
Magnetische Nanopartikel (MNP) von Magnetit (Fe3O4) wurden nach solvothermaler Methode hergestellt und mit SiO2 (MNP@SiO2) nach dem Stöber-Verfahren beschichtet, gefolgt von der Funktionalisierung mit APTES (MNP@SiO2@NH2). Dann wurde Feroxamin mit dem MNP@SiO2@NH2 durch Carbodiimid-Kupplung konjugiert, um MNP@SiO2@NH2@Fa zu geben. Die Morphologie und eigenschaften der Konjugat- und Zwischenprodukte wurden mit acht verschiedenen Methoden untersucht, darunter Pulver-Röntgenbeugung (XRD), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Raman-Spektroskopie, Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersive S-Ray-Mapping (EDX). Diese erschöpfende Charakterisierung bestätigte die Bildung des Konjugats. Schließlich, um die Kapazität und Spezifität der Nanopartikel zu bewerten, wurden sie in einem Capture-Bakterien-Assay mit Yersinia enterocoliticagetestet.
Introduction
Die Methoden zum Nachweis von Bakterien mit MNP basieren auf der molekularen Erkennung von Antikörpern, Aptamen, Bioproteinen, Kohlenhydraten, die von den pathogenen Bakterien 1 mit MNP konjugiertwerden. Unter Berücksichtigung, dass Siderophore von bestimmten Rezeptoren auf der äußeren Membran von Bakterien erkannt werden, könnten sie auch mit MNP verbunden werden, um ihre Spezifität zu erhöhen2. Siderophore sind kleine organische Moleküle, die an der Fe3+-Aufnahme durch Bakterien beteiligt sind3,4. Die Herstellung von Konjugaten zwischen Siderophoren und MNP zusammen mit ihrer Bewertung für die Abscheidung und Isolierung von Bakterien wurde noch nicht berichtet.
Einer der entscheidenden Schritte bei der Synthese von Konjugaten magnetischer Nanopartikel mit kleinen Molekülen ist die Auswahl der Art der Bindung oder Interaktion zwischen ihnen, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül an der Oberfläche des MNP befestigt wird. Aus diesem Grund konzentrierte sich das Verfahren zur Herstellung des Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und Feroxamin – dem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor – auf die Erzeugung einer veränderbaren Oberfläche des MNP, um es durch Carbodiimidchemie kovalent mit dem Siderophor zu verbinden. Um ein gleichmäßiges Magnetit-Nanopartikel (MNP) zu erhalten und die Keimbildung und Größenkontrolle zu verbessern, wurde in einem thermischen Block eine Solvolyse-Reaktion mit Benzylalkohol ohne Schütteln5durchgeführt. Dann wurde mit der Stöber-Methode eine Kieselsäurebeschichtung erzeugt, um Schutz zu gewähren und die Stabilität der Nanopartikelsuspension in wässrigen Medien zu verbessern6. Unter Berücksichtigung der Struktur des Feroxamins ist die Einführung von Amingruppen notwendig, um geeignete Nanopartikel (MNP@SiO2@NH2) herzustellen, die mit dem Siderophor konjugiert werden. Dies wurde durch Kondensation von (3-Aminopropyl)Triethoxysilan (APTES) mit den auf der Oberfläche der Kieselsäure modifizierten Nanopartikel (MNP@SiO2) mit einer Sol-Gel-Methode7erreicht.
Parallel dazu wurde der Feroxamin-Eisen(III)-Komplex durch Komplexierung des handelsüblichen Deferoxamins mit Eisenacetylaceton in wässriger Lösung hergestellt. NN-Succinylferoxamin, tragende Succinylgruppen, die als Linker fungieren, wurde durch die Reaktion von Feroxamin mit Bernsteinanhydrid erhalten.
Die Konjugation zwischen MNP@SiO2@NH2 und N-Succinylferoxamin, um MNP@SiO2@NHfazu geben, wurde durch Carbodiimid-Chemie unter Verwendung von Kupplungsreagenzien benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (di Methylamino)-Phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in einem weichen Basismedium zur Aktivierung der Terminalsäuregruppe in N-Succinylferoxamin8. N
Nachdem die MNPs charakterisiert wurden, bewerteten wir die Fähigkeiten von nackten und funktionalisierten magnetischen Nanopartikeln zur Erfassung des Wildtyps (WC-A) und eines Mutanten von Y. enterocolitica ohne Feroxaminrezeptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain MNPs, funktionalisierte MNPs und das Konjugat MNP@SiO2@NHFadurften mit jedem Y. enterocolitica Stamm interagieren. Die Bakterien-Konjugat-Aggregate wurden durch die Anwendung eines Magnetfeldes von der Bakteriensuspension getrennt. Die getrennten Aggregate wurden zweimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) abgetrennt, in PBS wieder aufgehängt, um serielle Verdünnungen vorzubereiten, und dann wurden sie für die Koloniezählung plattiert. Dieses Protokoll zeigt jeden Schritt der Synthese von MNP@SiO2@NH@Fa, die strukturelle Charakterisierung aller Zwischenprodukte und des Konjugats und einen Bakterium-Capture-Assay als einfache Möglichkeit, die Spezifität des Konjugats in Bezug auf die Zwischenprodukte zu bewerten. 9
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Synthese eines Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und dem Siderophor feroxamin durch kovalente Bindung. Die Synthese von Magnetit wurde mit dem von Pinna et al.5 gemeldeten Protokoll durchgeführt, gefolgt von einer Kieselsäurebeschichtung, um den magnetischen Korrosionskern in wässrigen Systemen zu schützen, die Aggregation zu minimieren und eine geeignete Oberfläche für die Funktionalisierungbereitzustellen 6. Das Kieselsäu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Professor Klaus Hantke (Universität Tübingen) für die freundliche Versorgung der yersinia enterocolitica-Stämme, die in diesem Werk verwendet werden. Diese Arbeit wurde durch Stipendien AGL2015-63740-C2-1/2-R und RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) der spanischen Staatlichen Agentur für Forschung (AEI) unterstützt, die vom FEDER-Programm der Europäischen Union kofinanziert wurde. Die Arbeit an der Universität Santiago de Compostela und der Universität A Corusa wurde auch durch die Stipendien GRC2018/018, GRC2018/039 und ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC Strategic Group) von Xunta de Galicia unterstützt. Abschließend möchten wir Nuria Calvo für ihre großartige Zusammenarbeit bei der Voice-off dieses Videoprotokoll danken.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
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