Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri
Summary
Questo lavoro descrive i protocolli per la preparazione delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguito dalla sua funzionalizzazione dell’amine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina utilizzando una moiety succinyl come linker. Una descrizione della caratterizzazione strutturale profonda e un assaggio di batteri di cattura utilizzando Y. enterocolitica per tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale sono anche descritti in dettaglio.
Abstract
Nel lavoro attuale, la sintesi delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguita dalla sua funzionalizzazione dell’ammine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina, un siderophore riconosciuto da Yersinia enterocolitica,utilizzando una moiety succinyl come linker sono descritti.
Le nanoparticelle magnetiche (MNP) della magnetite (Fe3O4) sono state preparate con metodo solvothermal e rivestite con SiO2 (MNP@SiO2)utilizzando il processo di Stober seguito dalla funzionalizzazione con APTES (MNP@SiO2@NH2). Poi, la feroxamina è stata coniugata con il MNP@SiO2@NH2 da accoppiamento carbodimide per dare MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfologia e le proprietà del coniugato e degli intermedi sono state esaminate con otto diversi metodi, tra cui la diffrazione in polvere X-Ray (XRD), la spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FT-IR), la spettroscopia Raman, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS), la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e la mappatura di dispersione energetica x-Ray (EDX). Questa caratterizzazione esaustiva confermò la formazione del coniugato. Infine, al fine di valutare la capacità e la specificità delle nanoparticelle, sono state testate in un test di cattura batteri utilizzando Yersinia enterocolitica.
Introduction
I metodi di rilevamento dei batteri utilizzando MNP si basano sul riconoscimento molecolare di anticorpi, aptamers, bioproteine, carboidrati coniugati a MNP dai batteri patogeni1. Tenendo conto che i siderofori sono riconosciuti da recettori specifici sulla membrana esterna dei batteri, potrebbero anche essere collegati a MNP per aumentare la loro specificità2. I siderofori sono piccole molecole organiche coinvolte nell’assorbimento di Fe3 dai batteri3,,4. La preparazione di coniugati tra siderophores e MNP insieme alla loro valutazione per la cattura e l’isolamento dei batteri non è ancora stata segnalata.
Uno dei passaggi cruciali nella sintesi di coniugati di nanoparticelle magnetiche con piccole molecole è la selezione del tipo di legame o di interazione tra di loro per garantire che la piccola molecola sia attaccata alla superficie del MNP. Per questo motivo, la procedura per preparare il coniugato tra nanoparticelle magnetiche e feroxamina – il sideroforo riconosciuto da Yersinia enterocolitica– si è concentrata sulla generazione di una superficie modificabile dell’MNP per consentire il collegamento covalente al sideroforo dalla chimica del carbodicolo. Al fine di ottenere una nanoparticelle magnetite uniformi (MNP) e per migliorare la nucleazione e il controllo delle dimensioni, una reazione di solvosi con alcool benzileè è stata trasportata in un blocco termico senza agitare5. Poi, un rivestimento di silice è stato generato dal metodo St’ber per conferire protezione e migliorare la stabilità delle sospensioni nanoparticelle in un supporto acquoso6. Tenendo conto della struttura della ferosamina, l’introduzione di gruppi di ammina è necessaria per produrre nanoparticelle adatte (MNP@SiO2@NH2) da coniugare con il siderophore. Ciò è stato ottenuto condensando (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) con i gruppi alcolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle modificate di silice (MNP@SiO2)utilizzando un metodo sol-gel7.
Parallelamente, il complesso di ferro di ferosamina(III) è stato preparato con la complessità della deferoxamina disponibile in commercio con acetonato di acetil di ferro in soluzione aques. N-succinylferoxamina, recante gruppi di succinyl che fungeranno da linker, è stata ottenuta dalla reazione della feroxamina con anidride succinica.
La coniugazione tra MNP@SiO2@NH2 e N-succinylferoxamine per dare MNP@SiO2@NH–Fa è stata effettuata attraverso la chimica del carbodiimide utilizzando come reagenti di accoppiamento benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio esafluorofosfato (BOP) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt) in un supporto di base morbido per attivare il gruppo di acido terminale in N-succinylferoxamine8.
Una volta che gli MNP sono stati caratterizzati, abbiamo valutato le capacità delle nanoparticelle magnetiche nude e funzionaliste per catturare il tipo selvaggio (WC-A) e un mutante di Y. enterocolitica privo del recettore della feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Gli MNP semplici, gli MNP funzionalizzati e i coniugati MNP@SiO2@NH–Fa sono stati autorizzati a interagire con ogni ceppo Y. enterocolitica. Gli aggregati battericoconiugi sono stati separati dalla sospensione dei batteri dall’applicazione di un campo magnetico. Gli aggregati separati sono stati sciacquati due volte con la salina tampina tamponata di fosfato (PBS), ri-sospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali e poi, sono stati placcati per il conteggio delle coccie. Questo protocollo dimostra ogni fase della sintesi di MNP@SiO2@NH@Fa, la caratterizzazione strutturale di tutti gli intermedi e il coniugato, e un analisi di cattura del batterio come un modo semplice per valutare la specificità del coniugato in relazione agli intermedi. 9 (in vie
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la sintesi di un coniugato tra nanoparticelle magnetiche e la ferosamina sideroforo mediante incollaggio covalente. La sintesi della magnetite è stata effettuata utilizzando il protocollo riportato da Pinna et al.5 seguito dal rivestimento in silice per proteggere il nucleo magnetico della corrosione nei sistemi acquosi, per ridurre al minimo l’aggregazione e per fornire una superficie adatta per la funzionalizzazione6. Il processo di rivestiment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il professor Klaus Hantke (Università di Tubinga, Germania) per aver gentilmente fornito i ceppi enterocolitica Yersinia utilizzati in questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni AGL2015-63740-C2-1/2-R e RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) dell’Agenzia statale per la ricerca (AEI) della Spagna, cofinanziato dal programma FEDE dell’Unione europea. Il lavoro svolto nell’Università di Santiago di Santiago di Compostela e dall’Università di A Coruèa è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni GRC2018/018, GRC2018/039 ed ED431E 2018/03 (gruppo strategico CICA-INIBIC) della Xunta de Galicia. Infine, vogliamo ringraziare Nuria Calvo per la sua grande collaborazione facendo la voce-off questo protocollo video.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
