סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים
Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקולים להכנת חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO2, ואחריו פונקציונליזציה האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקוניוגציה שלה עם דפרוקסמין באמצעות moiety מקשר. תיאור מבני עמוק באפיון וחיידק לכידת שיטת Y. enterocolitica עבור כל חלקיקי ביניים המשלים הסופי מתוארים גם בפרוטרוט.
Abstract
בעבודה הנוכחית, סינתזה של חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO2, ואחריו הפונקציונליזציה של האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקונאוציה שלה עם deferoxamine, siderophore המזוהה על ידי yersinia enterocolitica, באמצעות moiety סוקסיל כמקשר מ
חלקיקים מגנטיים (MNP) של מגנטיט (Fe3O4) הוכנו על ידי שיטת solvothermal מצופה עם SiO2 (MNP@SiO2) באמצעות תהליך STÖBER ואחריו פונקציונליזציה עם aptes (MNP@SiO2@NH2). לאחר מכן, פראוקאמין היה מצועם עם MNP@SiO2@NH2 על ידי צימוד קרבודיאימיד לתת MNP@SiO2@NH2@Fa. המבנה והמאפיינים של המשלים והintermediates נבדקו על-ידי שמונה שיטות שונות, כולל עקיפה לקרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיית פורייה (FT-IR), ספקטרוסקופיית, מיקרוסקופית רנטגן, ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון (XPS), מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור (TEM) ואנרגיה מפזרים מיפוי רנטגן. אפיון ממצה זה אישר את היווצרות המשלים. לבסוף, על מנת להעריך את היכולת ואת הספציפיות של חלקיקי חלקיקים, הם נבדקו בחיידק לכידת שיטת הלכידה באמצעות Yersinia בידור.
Introduction
שיטות גילוי חיידקים באמצעות MNP מבוססים על הכרה מולקולרית של נוגדנים, aptamers, ביופרוטאין, פחמימות מצופני MNP על ידי חיידקים פתוגניים1. נטילת בחשבון כי siderophores מזוהים על ידי קולטנים ספציפיים על הקרום החיצוני של חיידקים, הם יכולים גם לקשר MNP כדי להגדיל את הספציפיות שלהם2. Siderophores הם מולקולות אורגניות קטנות מעורב Fe3 + ספיגה על ידי חיידקים3,4. הכנת שערי מעלה בין siderophores ו MNP יחד עם ההערכה שלהם ללכוד ובידוד של חיידקים עדיין לא דיווחו.
אחד השלבים הקריטיים בסינתזה של שערי מעלה של חלקיקים מגנטיים עם מולקולות קטנות היא הבחירה של סוג של קשר או אינטראקציה ביניהם כדי להבטיח כי המולקולה הקטנה מחוברת למשטח של MNP. מסיבה זו, ההליך להכין את המשלים בין חלקיקים מגנטיים ופראוקמין-הסידרפור המזוהה על ידי Yersinia בידור-היה ממוקד בדור של משטח מאפשר של mnp כדי לאפשר קישור זה מתוך הסידרפור על ידי כימיה קרבודיאימיד. על מנת לקבל חלקיקים מגנטיט אחיד (MNP) ולשפר את הנוקלאוציה ובקרת גודל, תגובה solvolysis עם אלכוהול בנזיל נישא בלוק תרמי מבלי לרעוד5. לאחר מכן, ציפוי סיליקה נוצר על ידי שיטת Stöber כדי להעניק הגנה ולשפר את היציבות של השעיית חלקיקים במדיה מימית6. נטילת בחשבון את המבנה של feroxamine, המבוא של קבוצות אמין הוא הכרחי כדי לייצר חלקיקים מתאימים (MNP@SiO2@NH2) כדי להיות מצופף עם siderophore. זה הושג על ידי עיבוי (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) עם קבוצות אלכוהול להציג על פני השטח של חלקיקי סיליקה שונה (MNP@SiO2) באמצעות שיטת sol-ג’ל7.
במקביל, הקומפלקס feroxamine ברזל (III) הוכנו על ידי הcomplexation של מסחרית דפרוקסמין עם ברזל מרחלי באמצעות מימית הפתרון. N-סוסוסוקסימין, הנושאת קבוצות סוקסיניות שיפעלו כלינטים, הושגה על ידי תגובת פראוקמין עם אנהידריד סוקסילי.
הקוניוגציה בין MNP@SiO2@NH2 ו- N-סוקסיאמין לתת MNP@SiO2@NH–Fa בוצעה באמצעות כימיה קרבודיאימיד באמצעות הצימוד ריאגנטים benzotriazole-1-yl-אוקסי-טריס-(dimethylamino)-פוספוניום hexafluorophosphate (בופ) ו-1-hydroxybenzotriazole (הובט) במדיה בסיסית רכה כדי להפעיל את הקבוצה חומצה מסוף ב N-סולילפראמין8.
לאחר MNPs היו מאופיינים, הערכנו את היכולות של חלקיקים מגנטיים חשופים ופונקציונליזציה כדי ללכוד פראי סוג (WC-A) ומוטציה של Y. enterocolitica חסר קולטן פראוקאמין FoxA (FOXA WC-A 12-8). מאוד מסוג MNPs, הפונקציונליות של MNPs והמשלים MNP@SiO2@NH@הפא הורשו לקיים אינטראקציה עם זן Y. enterocolitica . החיידקים המשלים האגרגטים הופרדו החיידקים ההשעיה על ידי יישום של שדה מגנטי. האגרגטים המופרדים שטפו פעמיים בתמיסת מלח (PBS), מושעה מחדש ב-PBS כדי להכין מדלל סדרתי ולאחר מכן הם היו מצופים לספירת המושבה. פרוטוקול זה ממחיש כל שלב של הסינתזה של MNP@SiO2@NH @Fa, האפיון המבני של כל הintermediates והמשלים, ושיטת לכידת החיידק כדרך קלה להעריך את הספציפיות של המשלים ביחס לintermediates. מיכל בן 10
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של מקשר בין חלקיקי חלקיקים מגנטיים לבין הסימאואופור פראוקאמין באמצעות חיבור קוולנטי. סינתזה של מגנטיט בוצעה בפרוטוקול שדווח על-ידי פינה ואח ‘5 ולאחריה ציפוי סיליקה כדי להגן על הגרעין המגנטי של קורוזיה במערכות מימית, כדי למזער את הצבירה ולספק משטח מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בהכרת תודה פרופסור קלאוס האנטקה (אוניברסיטת טיבינגן, גרמניה) כדי לספק באדיבות את זנים בידור Yersinia המשמשים בעבודה זו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים AGL2015-63740-C2-1/2-R ו RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/פדר, האיחוד האירופי) מהסוכנות המדינה למחקר (AEI) של ספרד, ממומן על ידי תוכנית פדר מהאיחוד האירופי. עבודה באוניברסיטת סנטיאגו דה קומפוסטלה ואוניברסיטת A קורוניה נתמך גם על ידי מענקים GRC2018/018, GRC2018/039, ו ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC קבוצה אסטרטגית) מ Xunta דה גליסיה. בסופו של דבר, אנחנו רוצים להודות לנוריה קאלבו על שיתוף הפעולה הגדול שלה לעשות את הקול-off פרוטוקול וידאו זה.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
