İşlevselleştirilmiş Manyetik Nano partiküllerin sentezi, Siderofor Feroksamin ile Konjugasyonu ve Bakteri Tespiti Için Değerlendirilmesi
Summary
Bu çalışma manyetik nano tanecikleri hazırlanması için protokolleri açıklar, SiO ile kaplama2, ile amin fonksiyonelleştirme takip (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ve bir bağlayıcı olarak bir süksinyl moiety kullanarak deferoksamin ile çekimi. Derin bir yapısal karakterizasyon açıklaması ve tüm ara nano tanecikleri ve son konjuge için Y. enterocolitica kullanılarak yakalanan bakteri tahlilleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Bu çalışmada, manyetik nano partiküllerin sentezi, SiO ile kaplama2, amin fonksiyonelleştirme ile takip (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ve deferoksamin ile konjugasyonu, Yersinia enterocoliticatarafından tanınan bir siderofor , bir bağlayıcı olarak bir süksinil moiety kullanarak açıklanmıştır.
Manyetik nano tanecikler (MNP) manyetit (Fe3O4)solvotermal yöntemle hazırlanmış ve Stöber prosesi kullanılarak SiO2 (MNP@SiO2)ile kaplanmış ve ardından APTES ile işlevselleştirme (MNP@SiO2@NH2). Daha sonra, feroksamin MNP@SiO 22@NH2 karbodiimid kaplin ile MNP@SiO 2 @NH2@Fa vermek için konjuge edildi.2 Konjuge ve ara ların morfolojisi ve özellikleri toz X-Işını kırınımı (XRD), Fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), Raman spektroskopisi, X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS), iletim elektron mikroskobu (TEM) ve enerji dağıtıcı X-ışını (EDX) haritalama dahil olmak üzere sekiz farklı yöntemle incelendi. Bu ayrıntılı karakterizasyon eşlekap oluşumunu doğruladı. Son olarak, nano taneciklerin kapasitesini ve özgüllüğünü değerlendirmek için, yersinia enterocoliticakullanılarak bir yakalama bakteri testi nde test edildi.
Introduction
MNP kullanan bakteri algılama yöntemleri, patojenik bakteriler1tarafından MNP’ye konan antikorların, aptamerlerin, biyoproteinlerin, karbonhidratların moleküler olarak tanınmasına dayanmaktadır. Sideroforların bakterilerin dış zarındaki spesifik reseptörler tarafından tanındığı göz önünde bulundurularak, özgüllüklerini artırmak için MNP’ye de bağlanabilen2. Sideroforlar bakteriler in Fe3+ alımında yer alan küçük organik moleküllerdir3,4. Bakterilerin yakalanması ve izolasyonu için değerlendirmelerinin yanı sıra sideroforlar ve MNP arasında konjuge lerin hazırlanması henüz rapor edilmemiştir.
Küçük moleküller ile manyetik nano taneciklerin konjuge sentezinde önemli adımlardan biri küçük molekül MNP yüzeyine bağlı olduğundan emin olmak için aralarında bağ veya etkileşim türü seçimidir. Bu nedenle, manyetik nano tanecikleri ve feroksamin arasında konjuge hazırlamak için prosedür-Yersinia enterocoliticatarafından tanınan siderofor- karbodiimid kimya sıyrık tarafından siderofor kovalent bağlantı sağlamak için MNP değiştirilebilir bir yüzey üretimi ne odaklanmıştır. Düzgün bir manyetit nano tanecikleri almak için (MNP) ve çekirdekleşme ve boyut kontrolünü geliştirmek için, benzil alkol ile bir solvolysisreaksiyonusallayarak olmadan bir termal blok yapıldı 5 . Daha sonra, bir silika kaplama koruma vermek ve sulu ortamda nano tanecikleri süspansiyon istikrarını artırmak için Stöber yöntemi tarafından oluşturuldu6. Ferokramin yapısı dikkate alınarak, amin gruplarının giriş uygun nano tanecikleri üretmek için gereklidir (MNP@SiO2@NH2) siderofor ile konjuge olmak. Bu (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) silika modifiye nano tanecikleri yüzeyinde mevcut alkol grupları ile yoğuşma ile elde edildi (MNP@SiO2) bir sol-jel yöntemi kullanılarak7.
Buna paralel olarak, feroksamin demir (III) kompleksi sulu çözeltide demir asetil asetat ile ticari olarak kullanılabilir deferoksanin karmaşıklığı ile hazırlanmıştır. N-succinylferoxamine, bağlayıcı olarak hareket edecek süksinil grupları taşıyan, süksinik anhidrit ile feroksanin reaksiyonu ile elde edildi.
MNP@SiO 2 @NH22 ve N-succinylferoxamine arasında konjugasyon MNP@SiO vermek için2@NH@Fa kaplin reaktifler benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethyl olarak kullanılarak karbodiimid kimya ile yapılmıştır Amino)-fosfonyum hekzaflorofoffat (BOP) ve 1-hidroksibenzotriazol (HOBt) yumuşak bir temel ortamda N-succinylferoksamin8terminal asit grubunu etkinleştirmek için .
MNP’ler karakterize edildikten sonra, yabani tip (WC-A) ve feroksamin reseptörü FoxA’dan yoksun Y. enterokolitica mutantını yakalamak için çıplak ve işlevsel leştirilmiş manyetik nano partiküllerin yeteneklerini değerlendirdik (FoxA WC-A 12-8). Düz Milletvekilleri, işlevsel milletvekilleri ve eşlenik MNP@SiO2@NH@Fa her Y. enterocolitica zorlanma ile etkileşime izin verildi. Bakteri-eşlekapakları manyetik alan uygulaması ile bakteri süspansiyonundan ayrılmıştır. Ayrılmış agregalar iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulandı, seri seyreltmehazırlamak için PBS’de yeniden askıya alındı ve daha sonra koloni sayımı için kaplandı. Bu protokol, MNP@SiO2@NH@Fa sentezinin her adımını, tüm ara maddelerin yapısal karakterizasyonunu ve eşlekap’ı ve bir bakteri yakalama testini ara maddelerle ilgili olarak eşleninin özgüllüğünü değerlendirmenin kolay bir yolu olarak gösterir. 9.000
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, kovalent bağ ile manyetik nano tanecikleri ve siderofor feroktamin arasında bir konjuge sentezini açıklar. Manyetit sentezi pinna ve ark.5 tarafından bildirilen protokol kullanılarak yapıldı ve sulu sistemlerde korozyon manyetik çekirdek korumak için silika kaplama takip, toplama en aza indirmek ve fonksiyonelleştirme için uygun bir yüzey sağlamak için6. Silika kaplama işlemi değiştirildi. Li ve ark.6tarafından bildiri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Profesör Klaus Hantke’nin (Tübingen Üniversitesi, Almanya) bu çalışmada kullanılan Yersinia enterocolitica suşlarını nazilikle tedarik etmek için minnettarlıkla kabul ediyorlar. Bu çalışma, Avrupa Birliği’nden FEDER Programı tarafından ortaklaşa finanse edilen İspanya Araştırma Devlet Ajansı’ndan (AEI/FEDER, AB) AGL2015-63740-C2-1/2-R ve RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, AB) hibeleri ile desteklenmiştir. Santiago de Compostela Üniversitesi ve A Coruña Üniversitesi’ndeki çalışmalar da Xunta de Galiçya’dan GRC2018/018, GRC2018/039 ve ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC stratejik grubu) hibeleri ile desteklenmiştir. Son olarak, nuria Calvo’ya bu video protokolünü seslendirme deki büyük işbirliği için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
