تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.
Abstract
أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.
Introduction
الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أن له آثار جانبية سامة على الخلايا العصبية اللاإراية2. ومن المعروف أن الإرادي اللاإرادي وفرط التعصيب يمكن أن يؤدي إلى، أو يرافق، أمراض مثل مرض باركنسون أو مرض الكلى ارتفاع ضغط الدم3,4. وبالتالي ، فإن القدرة على إجراء البحوث وفهم آليات علم الأحياء والعيوب في سياق المرض مفيد للبحث عن علاجات جديدة وفعالة.
تشريح
يتفرع الجهاز العصبي المحيطي إلى الانقسامات الحسية واللاإراسية. الأعصاب المنفأة في الجهاز العصبي الحسي هي المسؤولة عن الإحساس بالألم واللمس ، في حين أن ANS مسؤولة عن نقل المعلومات من جميع الأجهزة إلى الدماغ. وينقسم ANS إلى الجهاز العصبي المعوي، والداخلية في الجهاز الهضمي، والجهاز العصبي شبه متعاطف، وهو أمر مهم للاسترخاء، والجهاز العصبي المتعاطف (SNS)، وهو أمر مهم لتنشيط / تنظيم الأجهزة. SNS تتكيف مع نظام اثنين من الخلايا العصبية5. المحاور العصبية المتعاطفة قبل ganglionic في الحبل الشوكي المشروع الأول إلى ganglia متعاطفة، حيث توجد أجسام الخلية symN ما بعد ganglionic. ثم ترسل هذه الخلايا العصبية إسقاطات طويلة لإيوينال الأنسجة المستهدفة من كل عضو في الجسم. الإشارات التي تنتقل عن طريق الخلايا العصبية قبل الغانغليونية هي الكوليني، في حين أن symNs ما بعد الغانغليونية هي التحسسية وبالتالي التعبير عن النورادرينالين (NE) كناقل عصبي رئيسي. هناك استثناءات قليلة ملحوظة من الخلايا العصبية ما بعد ganglionic, متعاطفة التي هي الكوليني, بما في ذلك تلك الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا العصبية الأيدرينرجية ما بعد ganglionic التعبير عن إنزيمات التيروزين هيدروكسيلاز (TH), العطرية L-الأمينية حمض decarboxylase (AAAD), الدوبامين α-هيدروكسيلاز (DBH), وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO-A), جميع المسؤولة عن توليد واستقلاب NE. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن ناقلات إعادة التدوير NE و / أو مستقبلات α-adrenergic (ADRA2)، مستقبلات الأدريين (ADR2B)، الناقل النورادرينالين (NET1)، وناقل اليورياميني الفيمركب (VMAT1/2).
التنميه
خلال تطور الجنين ية يتم اشتقاق symNs من القمة العصبية (NC), الذي يظهر بين الأنبوب العصبي وتراكب ectoderm6,ويمكن أن تفرق في أنساب متعددة الخلايا, بما في ذلك الخلايا الصباغية, العظام الخلايا, الخلايا الدهنية, غليا, الخلايا العصبية المعوية, الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية اللاإروية7. خلايا القمم العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تأخذ عدة طرق عبر الجنين. في هذه المرحلة المبكرة من NC التنمية، والخلايا التعبير عن علامات SNAIL1/2، FOXD3، وSOX108،9،10،11. يحدد مسار الترحيل مع الموقع المحوري الذي يتبنونه النوع الفرعي NC الذي ستتطور إليه. يمكن تمييز هذه الأنواع الفرعية NC من خلال التعبير الجيني HOX محددة: NCCs الجمجمة لا تعبر عن الجينات HOX, NCCs المبهمة التعبير HOX 1-5, NCCs الجذع التعبير HOX 6-9, وNCCs sacral التعبير HOX 10-1112. ومن بينها، يُعترف بمراكز الـ NCCs للجذع كمصدر رئيسي للسيومين. SymN السلائف التعبير عن عامل النسخ MASH1/ASCL113, الذي يعزز التعبير عن PHOX2B14 وINSM115. يتم التعبير عن عائلة GATA من عوامل النسخ أثناء التطور المتعاطف المتأخر. يتم التعبير عن GATA2 و GATA3 في symNs ، والتي بدورها ينشط DBH16. عامل النسخ HAND2 مهم أيضا للتعبير عن وصيانة DBH و TH17.
وخلايا HPSCs (مثل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة) هي أداة قوية18 لتلخيص النماذج التنموية وتوليد الخلايا السلية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لنمذجة الأمراض لمختلف الاضطرابات البشرية. وهكذا، فبينما تولد السيوم الوطني من المراكز الاستراتيجية الوطنية، من الأهمية بمكان اتباع المبادئ التوجيهية الإنمائية وتقييم التعبير عن العلامات المناسبة على طول عملية التمايز.
بروتوكول symN السابق
وقد ذكرت عدد قليل من مجموعات البحث سابقا توليد symNs من hPSCs19,20,21. المقارنة المباشرة لهذه البروتوكولات لبعضها البعض ولنا واستعرض مؤخرا22. في 201623, نشرنا بروتوكول التمايز لتوليد الخلايا العصبية اللاإراية مع حرف symN(الشكل 1A). استخدم هذا البروتوكول الوسيط القائم على KSR ، والذي تم استخدامه في كل من الحفاظ على hPSCs غير المتمايزة وتمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على hPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (الخلايا المغذية MEF). لقد وظفنا هذا البروتوكول وPSCs من المرضى الذين يعانون من FD لنموذج اضطراب23. في عام 2019 ، وصفنا نسخة أكثر تفصيلاً من هذا البروتوكول القديم24. باختصار ، تم حث المصير العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج25 لمنع إشارات TGF-α و BMP في اليومين الأولين. تعزيز تفعيل WNT باستخدام CHIR99021 السلف العصبية لتصبح خلايا NC. في اليوم 11، تم فرز الخلايا من قبل FACS لCD49D+ أو SOX10+ السكان26،23، والتي أسفرت عن حوالي 40٪ كفاءة الجيل NC. ومن ثم، فإن الفرز ضروري لضمان الكفاءة والنقاء للخطوات التالية للتمايز. تم الحفاظ على NCCs وتضخيمها كspheroids مع المعالجة المشتركة من FGF2 وCHIR. بعد 4 أيام، تم مطلي spheroids NC من الصيانة وأعطيت BDNF، GDNF، وNGF لإنهاء نضوج symN. على الرغم من أن هذه symNs أعرب عن علامات symN قوية مثل ASCL1, TH, DBH, و PHOX2A, علامات لsymNs أكثر نضجا, بما في ذلك التعبير عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (CHRNA3/CHRNB4) والناقل الحويصلة (VMAT1/2), كانت منخفضة حتى بعد 70 يوما من التمايز. لم يتم اختبار جينات HOX في هذا البروتوكول رسميًا ، ولم يتم التحقق من الخصائص العصبية الناضجة ، بما في ذلك النشاط الكهربي الفسيولوجي للخلايا.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لتوليد symNs(الشكل 1B). يتم الحفاظ على HPSCs في ظروف خالية من التغذية، على الأطباق المغلفة بالفيترونكتين (VTN)، باستخدام الوسائط الأساسية 8 (E8)27. وقد تم تعديل صيغة وسائل الإعلام التمايز في كل مرحلة، مما أدى إلى زيادة النسبة المئوية للسكان NC28. ويمكن القيام بنضوج symN على CD49D+/ SOX10+ فرزأو مجموعات NCC السائبة غير المصنفة. كلاهما تظهر مستويات عالية من التعبير علامة symN بحلول اليوم 30. وعلاوة على ذلك، فإن symNs ولدت مع هذا البروتوكول تستجيب للتسجيل الكهروفيزيولوجية والعلاجات مع المنشط symN والمركبات المثبطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
