Effektiv differensiering av postganglioniske sympatiske nevroner ved hjelp av humane pluripotente stamceller under materfrie og kjemisk definerte kulturforhold
Summary
I denne protokollen beskriver vi en stabil, svært effektiv differensieringsstrategi for generering av postganglioniske sympatiske nevroner fra humane pluripotente stamceller. Denne modellen vil gjøre nevroner tilgjengelig ei bruk av studier av flere autonome lidelser.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSCer) har blitt et kraftig verktøy for sykdomsmodellering og studiet av menneskelig embryonisk utvikling in vitro. Vi har tidligere presentert en differensieringsprotokoll for avledning av autonome nevroner med sympatisk karakter som har blitt brukt på pasienter med autonom nevropati. Protokollen ble imidlertid bygget på Knock Out Serum Replacement (KSR) og materbaserte kulturforhold, og for å sikre høy differensieringseffektivitet var cellesortering nødvendig. Disse faktorene forårsaker høy variasjon, høye kostnader og lav reproduserbarhet. Videre har modne sympatiske egenskaper, inkludert elektrisk aktivitet, ikke blitt verifisert. Her presenterer vi en optimalisert protokoll der PSC-kultur og differensiering utføres i materfrie og kjemisk definerte kulturforhold. Genetiske markører som identifiserer trunk neural crest er identifisert. Ytterligere differensiering til postganglioniske sympatiske nevroner oppnås etter 20 dager uten behov for cellesortering. Elektrofysiologisk opptak viser videre funksjonell nevron identitet. Avfyring oppdaget fra våre differensierte nevroner kan forbedres av nikotin og undertrykkes av adrenerge reseptorantagonist propranolol. Mellomliggende sympatiske nevrale stamfarer i denne protokollen kan opprettholdes som nevrale spheroider i opptil 2 uker, noe som gjør det mulig å utvide kulturene. I sum viser vår oppdaterte sympatiske nevrondifferensieringsprotokoll høy differensieringseffektivitet, bedre reproduserbarhet, mer fleksibilitet og bedre neural modning sammenlignet med den forrige versjonen. Denne protokollen vil gi forskere cellene som er nødvendige for å studere menneskelige lidelser som påvirker det autonome nervesystemet.
Introduction
Postganglionic sympatiske nevroner (symNer) tilhører det autonome nervesystemet (ANS) og har flere viktige roller i å svare og regulere homeostase av kroppen uavhengig av bevissthet. For eksempel stimulerer stress symNer og fremkaller kamp-eller-fly respons som fører til en økning i hjertefrekvens, blodtrykk og svette. SymNer påvirkes i flere menneskelige lidelser på grunn av genetikk, toksisitet/skade, eller som følgesvenner til andre sykdommer. Et eksempel på en genetisk nevropati er barndomsforstyrrelsen Familiær dysautonomi (FD), hvor en alvorlig dysregulering av symNer forårsaker dysautonom krise, tydelig ved svette, flekking av huden, oppkast angrep, hypertensjon og angst1. Et eksempel på toksisitet er kjemoterapi behandling, som er rapportert å ha toksiske bivirkninger på autonome nevroner2. Det er kjent at autonom denervation og hyper-inervation kan både føre til, eller følge, sykdommer som Parkinsons sykdom eller hypertensiv nyresykdom3,4. Dermed er det gunstig å kunne drive forskning og forstå mekanismene til symNbiologi og defekter i sammenheng med sykdom for søken etter nye og effektive behandlinger.
Anatomi
Det perifere nervesystemet grener inn sensoriske og autonome divisjoner. De afferent nervene i sensorisk nervesystemet er ansvarlige for følelse av smerte og berøring, mens ANS er ansvarlig for å videresende informasjon fra alle organer til hjernen. ANS er delt inn i det enteriske nervesystemet, innervating mage-tarmkanalen, det parasympatiske nervesystemet, som er viktig for avslapning, og det sympatiske nervesystemet (SNS), som er viktig for aktivering / regulering av organer. SNS tilpasser et to-neuron system5. Preganglionic sympatiske nevrale aksoner i ryggmargen første prosjektet til sympatiske ganglia, hvor postganglionic symN celleorganer er plassert. Disse nevronene sender deretter lange projeksjoner for å innervate målet vev av hvert organ i kroppen. Signaler som overføres av preganglionic nevroner er kolinerge, mens postganglionic symNer er adrenerge og dermed uttrykke noradrenalin (NE) som deres viktigste nevrotransmitter. Det er få bemerkelsesverdige unntak av postganglionic, sympatiske nevroner som er kolinerge, inkludert de som innerver blodkar. Adrenerge postganglionic nevroner uttrykke enzymer tyrosin hydroksylase (TH), aromatisk L-aminosyre decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroksylase (DBH), og monoamin oksidase (MAO-A), alle ansvarlig for å generere og metabolisere NE. Videre uttrykker de NE resirkulering transportører og / eller reseptorer α-adrenerge reseptor (ADRA2), β-adrenerge reseptor (ADR2B), noradrenalin transportør (NET1), og vesikulær monoamin transportør (VMAT1/2).
Utvikling
Under embryonalutvikling symNer er avledet fra neural crest (NC), som oppstår mellom nevrale røret og overlegge ectoderm6, og kan differensiere i flere cellelinjer, inkludert melanocytter, osteoblaster, adipocytter, glia, enteriske nevroner, sensoriske nevroner, og autonome nevroner7. Neural crest celler (NCCer) er svært trekkfugler celler som tar flere ruter gjennom embryoet. På dette tidlige stadiet av NC utvikling, cellene uttrykke markørene SNAIL1/2, FOXD3, og SOX108,9,10,11. Migrasjonsruten sammen med aksialplasseringen de vedtar bestemmer NC-undertypen de vil utvikle. Disse NC-undertypene kan skilles ut av deres spesifikke HOX-genuttrykk: Kraniale NCCer uttrykker ikke HOX-gener, vagal NCCer uttrykker HOX 1–5, trunk NCCer uttrykker HOX 6–9, og sakrale NCCer uttrykker HOX 10–1112. Blant dem er trunk NCCer anerkjent som den viktigste kilden til symNer. SymN-forløpere uttrykker transkripsjonsfaktoren MASH1/ASCL113, som fremmer uttrykk for PHOX2B14 og INSM115. GATA-familien av transkripsjonsfaktorer uttrykkes under sen sympatisk utvikling. GATA2 og GATA3 uttrykkes i symNene, som igjen aktiverer DBH16. Transkripsjonsfaktoren HAND2 er også viktig for uttrykk og vedlikehold av DBH og TH17.
HPSCer (f.eks. embryonale og induserte pluripotente stamceller) er et kraftig verktøy18 for å rekapitulere utviklingsparadigmer og generere symNer som deretter kan brukes til sykdomsmodellering av ulike menneskelige lidelser. Dermed, mens du genererer symNer fra hPSCer, er det avgjørende å følge utviklingsretningslinjer og vurdere uttrykk for passende markører langs differensieringsprosessen.
Tidligere symN-protokoll
Få forskningsgrupper har tidligere rapportert generering av symNer fra hPSCs19,20,21. Den direkte sammenligningen av disse protokollene til hverandre og vår ble gjennomgått nylig22. I 201623publiserte vi en differensieringsprotokoll for generering av autonome nevroner med symN-karakter (figur 1A). Denne protokollen brukte KSR-basert medium, som ble brukt i både vedlikehold av udifferensierte hPSCer og celledifferensiering. Videre ble hPSCer opprettholdt på mus embryonale fibroblaster (MEF materceller). Vi brukte denne protokollen og PsCer fra pasienter med FD for å modellere lidelsen23. I 2019 beskrev vi en mer detaljert versjon av denne eldre protokollen24. Oppsummert, nevrale skjebnen ble indusert av dual SMAD hemming25 å blokkere TGF-β og BMP signalisering i de første 2 dagene. WNT-aktivering ved hjelp av CHIR99021 fremmet nevrale forfedre til å bli NC-celler. På dag 11 ble cellene sortert etter FACS for CD49D+ eller SOX10+ populasjoner26,23, som ga ca 40% NC generasjon effektivitet. Dermed var sortering nødvendig for å sikre effektivitet og renhet for de neste trinnene i differensiering. NcCs ble opprettholdt og forsterket som spheroids med kombinert behandling av FGF2 og CHIR. Etter 4 dager ble NC-spheroidene for vedlikehold belagt og gitt BDNF, GDNF og NGF for å fullføre symN-modningen. Selv om disse symN-merkene uttrykte sterke symN-markører som ASCL1, TH, DBH og PHOX2A, var markører for mer modne symNer, inkludert uttrykk for nikotinacetylkolinreseptoren (CHRNA3/CHRNB4) og vesikeltransportør (VMAT1/2), lav selv etter 70 dager med differensiering. HOX-gener i denne protokollen ble ikke formelt testet, og modne nevrale egenskaper, inkludert elektrofysiologisk aktivitet av cellene, ble ikke verifisert.
Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å generere symNer (figur 1B). HPSCer vedlikeholdes i materfrie forhold, på vitronectin (VTN)-belagte retter, ved hjelp av Essential 8 (E8) media27. Formelen for differensieringsmediet er endret på hvert trinn, og dermed øke prosentandelen av NC-populasjonen28. SymN modning kan gjøres på CD49D+/SOX10+ sortert eller usortert bulk NCC populasjoner. Begge viser høye nivåer av symN markør uttrykk av dag 30. Videre er symNene som genereres med denne protokollen, responsiv til elektrofysiologisk opptak og behandlinger med symN-aktivator og inhibitorforbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har nylig publisert to vurderinger, en som diskuterer bruken av hPSC-avledede symNer for sykdomsmodellering31, samt en grundig sammenligning av tilgjengelige differensieringsprotokoller22. Dermed fokuserer vi her på å feilsøke den nåværende protokollen for å hjelpe den interesserte forskeren med å lykkes i å lage symNer. Under hele differensieringsprosessen, for å få konsistente data samt friske differensierte celler, bør kontaminering i alle stadier kontrolle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Heidi Ulrichs for kritisk lesing og redigering av manuskriptet.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
