Summary
Für multipleX-Immunostaining mit primärer Antikörper aus der gleichen Wirtsart wurden verschiedene Methoden etabliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Mikrowellen-vermittelten Antikörper-Stripping und von Fluorophor-Tyramid, um Antikörper-Kreuzreaktivität während multiplex-immunostaining auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Mausnebennierenabschnitten zu blockieren.
Abstract
Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um die zelluläre Expression Muster eines bestimmten Proteins zu zeigen. Multiplex-Immunostainierung ermöglicht die Etikettierung mit mehreren primären Antikörpern. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität zu minimieren, erfordert multiplexe Immunfärbung mit indirekter Färbung unbeschriftete Primärantikörper verschiedener Wirtsarten. Die geeignete Kombination verschiedener Artenantikörper ist jedoch nicht immer verfügbar. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung unbeschrifteter Primärantikörper derselben Wirtsart (z.B. in diesem Fall stammen beide Antikörper von Kaninchen) zur Multiplex-Immunfluoreszenz auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten. Bei dieser Methode wird das gleiche Verfahren und die gleichen Reagenzien verwendet, die im Antigen-Retrieval-Schritt verwendet werden, um die Aktivität des zuvor gebeizten Primärantikörperkomplexes zu entfernen. Die Dias wurden mit dem ersten primären Antikörper mit einem allgemeinen Immunfleckenprotokoll befleckt, gefolgt von einem Bindungsschritt mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Dann wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Signalentwicklungsmethode mit Fluorophor-Tyramid als Substrat verwendet. Die Immunaktivität des ersten primären Antikörperkomplexes wurde durch Eintauchen in eine Mikrowellen-Koch-Natriumcitratlösung für 8 min abgestreift. Die unlösliche Fluorophor-Tyramid-Ablagerung blieb auf der Probe, wodurch der Schlitten mit anderen primären Antikörpern gefärbt werden konnte. Obwohl diese Methode die meisten falsch positiven Signale eliminiert, kann ein gewisser Hintergrund von Antikörper-Cross-Reaktivität bleiben. Wenn die Proben mit endogenem Biotin angereichert sind, kann ein peroxidasekonjugierter Sekundärantikörper verwendet werden, um den biotinylierten Sekundärantikörper zu ersetzen, um das falsche Positiv aus wiedergewonnenem endogenem Biotin zu vermeiden.
Introduction
Bei multipleximmunostaining kann die direkte Färbung mit konjugierten Primärantikörpern informative Ergebnisse liefern. Ohne sekundäre Antikörper hat die direkte Färbemethode ein geringes Risiko für falsche Kolokalisierungssignale durch Antikörper-Kreuzreaktivität. Die konjugierten Reporter (Fluorophor, Enzyme) oder Biotin auf dem primären Antikörper begrenzen jedoch seine zukünftige Verwendung. Alternativ liefert die indirekte Immunfärbung in der Regel stärkere Signale, indem ein nicht konjugierter Primärantikörper mit einem markierten sekundären Antikörper verwendet wird. Idealerweise sollten nicht konjugierte primäre Antikörper, die in Multiplex-Immunostainierung verwendet werden, von verschiedenen Wirtsarten stammen, um Antikörper-Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die geeignete Kombination von Primärantikörpern verschiedener Wirtsarten ist jedoch nicht immer verfügbar.
Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um das Risiko zu beseitigen, dass der sekundäre Antikörper mit einem unerwünschten primärantikörper reagiert. Eine gängige Methode ist die Verwendung eines monomeren F(ab) Antikörpers, um alle verbleibenden Bindungsepitope auf dem ersten primären Antikörperkomplex zu blockieren, bevor der zweite primäre Antikörper1gefärbt wird. Das Abisolieren von Antikörpern, das dem Streifen und der Reprobe eines westlichen Fleckenblattes ähnelt, entfernt den zuvor gebeizten Antikörperkomplex, ohne die Ablagerung nachweisbarer Reportermoleküle wie 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)2 und die fluoreszierende Tyramidabscheidung3zu entfernen. Mit dieser Methode können Reportermoleküle in verschiedenen Farben ein Multiplex-Ergebnis auf derselben Folie anzeigen. Die Multiplexfärbung ist auch durch die vollständige Entfernung der zuvor abgelagerten Antikörperschichten und die Ausrichtung nachträglich aufgenommener Bilder von anderen Antikörpernerreichbar 4,5. Diese Methoden liefern alle zuverlässige Ergebnisse, obwohl jede Methode ihre Grenzen hat und entweder komplizierte Verfahren oder ein spezielles Bildgebungssystem erfordert.
Das vorliegende Protokoll zeigt die Anwendung einer Antikörper-Stripping-Methode unter Verwendung allgemein verfügbarer Puffer. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten mit zwei nicht beschrifteten primär antikörpern den gleichen Wirtsarten durchzuführen.
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Protocol
1. Färbung mit dem ersten Antikörper
- FFPE-Dias mit 5 min auf jede der folgenden Schritte zuteilen: Xylol oder gleichwertige Reagenzien 3x, 100% Ethanol 2x, 95% Ethanol 1x, 70% Ethanol 1x, 50% Ethanol 1x und destilliertes Wasser 2x.
HINWEIS: Folien sollten von diesem Rehydrierungsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben. - Für den optionalen Antigen-Abruf die Dias in 275 ml kochende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0) für 8 min legen. Um die Lösung am Kochen zu halten, legen Sie die Dias flach auf die Unterseite einer 14 x 9,5 x 9 cm3 (B x L x H) Pipettenkippdose mit Deckel und Mikrowelle die Lösung auf 70% Leistung in einem 700 W Mikrowellenherd für 8 min. Dann entfernen Sie die Pipettenkippdose aus dem Mikrowellenherd, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) mindestens 20 min abkühlen.
- Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das PBST enthält (phosphatgepufferte Saline mit 0,1% Polysorbat 20/80). Mit PBST für 5 min 3x waschen. Wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt wechseln, lagern Sie die Dias in diesem Schritt mit PBST in einem Coplin-Glas bei RT für ein paar Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage, wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt übergehen.
- Um die Blockierlösung vorzubereiten, verwenden Sie das normale Serum der Wirtsart des sekundären Antikörpers als blockierendes Reagenz. Es können auch andere kommerzielle Blockierreagenzien verwendet werden. Wenn Sie normales Serum für die in dieser Studie vorgestellte Studie verwenden, fügen Sie 100 l normales Eselsserum zu 4,9 ml PBST hinzu. Die Sperrlösung kann bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden.
- Zum Blockieren den PBST von den Dias abschütteln und schnell mit einer ausreichenden Blockierlösung abdecken. Inkubieren Sie die Dias bei RT in einer befeuchteten Kammer für 30 min.
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung (500 l für zwei Dias) mit der Blockierlösung vor, um den primären Antikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen. Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
- Fügen Sie für 3-HSD 2 l 3-HSD in 498 L der Blockierlösung hinzu.
- Fügen Sie für TH 0,5 l TH-Antikörper in 499 l der Blockierlösung hinzu.
- Fügen Sie für die Blockierlösung 1 l des A-Catenin-Antikörpers in 499 l der Blockierlösung hinzu.
- Für 20-HSD, fügen Sie 1 l von 20-HSD-Antikörper in 499 L der Blockierlösung.
- Fügen Sie für CYP2F2 2 L CYP2F2-Antikörper in 498 L der Blockierlösung hinzu.
- Mit dem primären Antikörper bebrüten, indem sie die Blockierende Lösung von den Dias abschütteln und sie schnell mit einer ausreichenden primären Antikörperlösung abdecken. Die Dias in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei 4 °C inkubieren. Während der Inkubation können die Dias mit einem kleinen Stück Paraffinfolie abgedeckt werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Am nächsten Morgen waschen Sie die Rutschen mit PBST für 5 min 3x.
- Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung (500 l für zwei Dias) mit der Blockierlösung vor, um den biotinylierten Sekundärantikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 1 L Esel-Anti-Maus-Antikörper oder Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper in 499 l Lösung). Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
- Mit dem zweiten Antikörper bebrüten, indem man PBST von den Dias abschüttelt und schnell mit ausreichender Sekundärantikörperlösung bedeckt. Inkubieren Sie die Dias in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT.
HINWEIS: Wenn endogenes Biotin ein Problem ist, verwenden Sie einen peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper anstelle des biotinylierten Sekundärantikörpers. Springen Sie zu Schritt 1.14, wenn Sie einen peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper in Schritt 1.10 verwenden. - Waschen Sie die Dias mit PBST für 5 min 3x.
- Bereiten Sie die Mitrad-Peroxidase-konjugierte Streptavidin-Lösung (SA-HRP) (500 l für zwei Dias) vor, indem Sie 0,5 l SA-HRP in 499 L PBS einzuteilen. Die Endkonzentration liegt bei 1 g/ml.
- Inkubieren Sie mit der SA-HRP-Lösung. Schütteln Sie PBST von den Dias ab und decken Sie die Dias schnell mit ausreichender SA-HRP-Lösung ab. Inkubieren Sie die Dias in einer befeuchteten Kammer für 0,5 h bei RT.
- Waschen Sie die Dias mit PBST für 5 min 3x.
- Bereiten Sie die Fluorophor-Tyramid-Lösung vor, indem Sie Fluorophor-Tyramid mit seinem Verdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen (z. B. 5 l Fluorophor-Tyramid in 496 L Verdünnungspuffer).
- Führen Sie die Signalentwicklung mit Fluorophor-Tyramid durch Abschütteln von PBST von den Dias und schnelles Abdecken der Dias mit ausreichender Fluorophor-Tyramid-Lösung durch. Inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer für 1 min bei RT. Die Inkubationszeit kann angepasst werden, um die gewünschte Fluoreszenzintensität zu erhalten. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Dias in ein Coplin-Glas übertragen, das PBST enthält. Schlitten mit PBST für 3 min 2x waschen.
- Signale können schnell unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, um das Ergebnis in diesem Stadium zu bestätigen. Wenn Keine Abdeckungen verwendet werden, tragen Sie einen Tropfen Glycerin auf jeden Abschnitt auf, um die Proben feucht zu halten. Schlitten mit PBST für 3 min 2x waschen. Die Dias können in PBST bei 4 °C für einige Tage gelagert werden, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.
2. Entfernen Sie den ersten Antikörper
- Legen Sie die Dias in 275 ml kochende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0) für mindestens 8 min. Halten Sie die Lösung kochend, indem Sie die Dias flach auf den Boden einer 14 x 9,5 x 9 cm3 (B x L x H) Pipettenkippe mit Deckel und Mikrowaving der Lösung auf 70% Leistung in einem 700 W Mikrowellenherd für 8 min. Wenn eine längere Abisolierzeit bevorzugt wird, kann es erforderlich sein, den Puffer mit einer kochenden Natriumcitratlösung abzuladen, um die Dias jederzeit in Pufferlösung einzutauchen. Entfernen Sie die Pipettenkippdose aus dem Mikrowellenherd, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung bei RT mindestens 20 min abkühlen.
- Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das PBST enthält. Mit PBST für 5 min 3x waschen. Wenn der nächste Schritt nicht sofort durchgeführt wird, lagern Sie die Dias in einem Coplin-Glas mit PBST bei RT für ein paar Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage.
3. Fleck mit dem zweiten Antikörper
- Beginnen Sie mit dem Blockierungsschritt und folgen Sie den gleichen Verfahren in Schritt 1.5 bis Schritt 1.14. Verwenden Sie bei den Signalentwicklungsschritten (Schritt 1.15 und Schritt 1.16) das Fluorophor-Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum.
HINWEIS: Folien können mit dieser Methode mehrmals entfernt werden, um Multiplexfärbung zu ermöglichen. Der letzte Antikörper benötigt als Reporter kein Fluorophor-Tyramid. Ein fluorophorkonjugierter Sekundärantikörper könnte verwendet werden, um Signale des letzten primären Antikörpers anzuzeigen. - Inkubieren Sie Dias mit 2 g/ml 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Hoechst-Lösung für 1 min bei RT, wenn nukleare Gegenfärbung erforderlich ist. Dann waschen Sie die Dias mit PBST für 3 min 2x.
4. Imaging mit einem Fluoreszenzmikroskop zur Erkennung von Signalen
- Montieren Sie einen Deckelschlupf mit einem Tropfen Montagemedium, der für die Immunfluoreszenz geeignet ist.
- Verwenden Sie für die Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop, um Signale jedes Fluoreszenzkanals zu erkennen. Beginnen Sie mit dem Kernfärbungskanal (DAPI) und der 4x Linse, um das Gewebe auf dem Dia zu lokalisieren.
- Wechseln Sie zur Bildgebung auf das 10-fache Objektiv. Passen Sie die Belichtungszeit (300 ms) und die Lichtquellenintensität (80 % Intensität) an. Passen Sie diese Einstellungen an, wenn das Signal zu hell oder zu dunkel ist. Nehmen Sie Fotos von jedem Kanal auf, ohne die Bühne zu bewegen. Für jeden Kanal kann eine Neuausrichtung erforderlich sein. Führen Sie die Bilder von jedem Kanal mit der Software des Mikroskops oder ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) zusammen.
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Representative Results
Die Ergebnisse wurden aus Proben gewonnen, die mit allen beschriebenen Schritten einschließlich des Antigen-Abrufschritts 1.2 behandelt wurden. Alle hier verwendeten sekundären Antikörper wurden biotinyliert. Fluorophor-Tyramid wurde verwendet, um Signale aus dem ersten und zweiten primären Antikörper zu entwickeln. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Würfel (für grüne Fluoreszenz), einem TxRED-Würfel (für Cy3) und einem DAPI-Würfel (für DAPI) aufgenommen.
Mikrowaving-vermitteltes eliminiert die Kreuzreaktivität.
Maus FFPE Nebennierenabschnitte wurden mit zwei primären Kaninchen-Antikörper neinig. Ohne Stripping (Abbildung 1A-C) nahm der sekundäre Antikörper für TH 3-HSD(+)-Standorte auf und gab rote Signale in der Nebennierenrinde (Abbildung 1B). Der Mangel an führte zu den falschen Kolokalisierungssignalen in Gelb (Abbildung 1C). Diese Kreuzreaktivität stammt aus (1) dem HRP-Enzym, das die erste Tyramidreaktion und (2) die Antikörperart Kreuzreaktivität katalysierte. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität und das HRP aus der ersten Immunfärbung zu entfernen, haben wir eine 1 min (Abbildung 1D-F) und eine 8 min Mikrowellen-vermittelte Stripping getestet (Abbildung 1G-I). Beide Behandlungen reichten aus, um das unspezifische Signal zu eliminieren, was saubere doppelte FärbungErgebnisse(Abbildung 1F,I). Die negative Kontrolle folgte allen gleichen Schritten mit Ausnahme der Inkubation mit primären Antikörpern (Abbildung 1J). Bei der Negativkontrolle wurde kein signifikantes Signal aufgenommen. Wir fanden heraus, dass eine 8 min Stripping in einem kochenden Citratpuffer ausreichte, um Antikörper-Kreuzreaktivität für viele Antikörper zu beseitigen, die häufig in der Nebenniere verwendet werden (Abbildung 2).
Die Einschränkung — die Wirksamkeit des Mikrowellen-vermittelten Abisolierens ist antikörperabhängig.
Obwohl das in diesem Protokoll verwendete Mikrowellen-vermittelte Abisolieren in den meisten Fällen funktioniert, gibt es Einschränkungen für diese Methode. Bei einigen Antikörpern kann eine Mikrowellen-vermittelte Abisoliermethode mit einem Citratpuffer die Antikörper-Kreuzreaktivität möglicherweise nicht vollständig entfernen. Zum Beispiel entfernte eine 8 min Stripping die meisten unspezifischen Signale aus dem Maus-Anti-TH-Antikörper und dem Maus-Anti-CYP2F2-Antikörper, aber ein schwaches falsch positives Signal war immer noch nachweisbar (die Medulla in Abbildung 3E und der innere Kortex in Abbildung 3K). Beachten Sie, dass eine Erhöhung der Mikrowaving-Zeit auf 20 min immer noch nicht vollständig Antikörper-Kreuzreaktivität entfernt (Abbildung 3H,K).
Abbildung 1: Repräsentative Doppelimmunfärbung auf P1 FFPE-Maus-Adrenals. FFPE-Maus-Nebennierenabschnitte wurden mit zwei primären Antikörpern von Kaninchen gefärbt: Anti-3-HSD (grün = Kortex), Anti-TH (rot = medulla). Die drei Gruppen von Flecken umfassen die drei verschiedenen Stripping-Verfahren verwendet: (A-C) kein Abisolieren, (D-F) 1 min Stripping, und (G-I) 8 min Stripping. Beachten Sie, dass ohne Mikrowaving der sekundäre Antikörper mit TH immer noch 3-HSD-Signale aufnahm, während spezifische Färbeergebnisse in den 1 min und 8 min Mikrowellen-behandelten Gruppen erzielt wurden. Es gibt kein positives Signal in der Negativkontrolle, nicht mit primären Antikörpern inkubiert. Skala bar = 100 m. DAPI = Zellkerne, blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Doppelimmunfärbung auf P21 FFPE-Maus-Adrenals. Die FFPE-Maus-Nebennierenabschnitte wurden mit zwei primären Antikörpern von Kaninchen in der folgenden Reihenfolge gefärbt: Anti-A-Catenin (grün = äußerer Kortex) und dann Anti-20-HSD (rot = innerer Kortex). Dazwischen wurde ein 8-min-Strippenschritt durchgeführt. Skala bar = 100 m; DAPI = Zellkerne, blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Einige Antikörper sind möglicherweise nicht vollständig abgestreift, was zu schwachen unspezifischen Signalen führen kann. Die FFPE-Maus-Nebennierenabschnitte wurden mit zwei primären Antikörpern von Mäusen gefärbt: Anti-CYP2F2 (grün = innenrintex) und anti-TH (rot = medulla). Die Ergebnisse der Nicht-Abisoliergruppe (A-C) zeigten, dass die Reaktionen zum Nachweis des CYP2F2-Proteins den TH(+)-Bereich noch befleckten. Eine falsche Kolokalisierung wurde in der Nebennieren-Medulla (C) gesehen. Obwohl eine 8 min und eine 20 min Mikrowellenbehandlung die grüne Fluoreszenzintensität in der Medulla reduzierten, ist ein spürbarer Hintergrund noch vorhanden (D-I). Der Anti-CYP2F2-Antikörper ist ein weiteres Beispiel dafür, dass die Kreuzreaktivität auch nach 20 min Mikrowaving (J-L) nicht vollständig entfernt werden kann. Beachten Sie, dass es kein positives Signal in der Negativkontrolle gab, nicht mit primären Antikörpern inkubiert, was darauf hindeutet, dass das falsch positive Signal vom Antikörper-Kreuzreaktivität (M )stammte. Skala bar = 100 m; DAPI = Zellkerne, blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Multiplex-Immunostaining ist nützlich, um die zelluläre Kolokalisierung von zwei oder mehr Antigenen zu untersuchen. Diese weit verbreitete Technik liefert überzeugende Kolokalisierungsergebnisse, wenn primäre Antikörper mit verschiedenen Reportern konjugiert werden (direkte Färbung). Jedoch, direkte Färbung bietet in der Regel schwächere Signale im Vergleich zu indirekten Färbung, die konjugierte sekundäre Antikörper beinhaltet, um die primären Antikörper zu erkennen. Bei der indirekten Färbung beruht ein hochwertiges Multiplex-Immunostaining-Ergebnis darauf, ob die sekundären Antikörper zwischen den verschiedenen primären Antikörpern unterscheiden können. Aufgrund der möglichen Antikörper-Kreuzreaktivität wird Multiplex-Färbung unter Verwendung der indirekten Färbemethode bei primären Antikörpern verschiedener Wirtsarten deutlicher gesehen. Carl und andere entwickelten ein Protokoll mit einem Überschuss an unkonjugiertem IgG F(ab)-Fragment, um Antikörper-Cross-Reaktivität zu blockieren1. Eine ähnliche Strategie wird in der "Maus-auf-Maus"-Färbung verwendet, die einen Monomeriker-Anti-Maus-Antikörper von F(ab) verwendet, um zu verhindern, dass der Anti-Maus-Sekundärantikörper ein endogenes Maus-Immunglobulin im Gewebe erkennt. Diese Blockierungsmethode ist jedoch zeitaufwändig und kann Antikörper aus früheren Schritten nicht vollständig blockieren, insbesondere wenn die nachweisenden Antigene von hoher Häufigkeit sind2.
Wärmevermitteltes Abisolieren ist eine weitere Methode, um Antikörper-Kreuzreaktivität bei Multiplex-Immunostaining zu verhindern. Das Konzept ähnelt der Strip- und Reprobe-Methode eines Western Blot. Die Verwendung einer Mikrowelle zum Kochen der Dias in einem Citratpuffer hatte einen deutlichen positiven Effekt auf die Blockierung der Antikörper-Kreuzreaktivität. Zwei 5 min Mikrowellenbehandlungen zwischen sequenziellen Runden der farbmetrischen Immunfärbung ermöglichen den Nachweis mehrerer Antigene auf demselben Dia mit monoklonalen Mausantikörpern2. Mikrowellenbehandlungen in Kombination mit der Thyramid-Signalverstärkungsmethode (TSA), bei der Fluorophor-Tyramid als Substrat von HRP verwendet wird, sind auch für die Immunfluoreszenz-Doppelfärbung3,6,7" nützlich. Die Mikrowellenbehandlung zwischen dem ersten und zweiten Färbezyklen blockiert die Aktivität des ersten Immunkomplexes, ohne seine fluoreszierende Tyramidfällung auszuwaschen. Eine Mikrowellenbehandlung kann jedoch nicht in der Lage sein, eine Kontamination bei der Färbung vollständig zu verhindern8. Obwohl einige Methoden mit verschiedenen Arten von Stripping-Puffern eine bessere Abisolierwirkung bieten können, sind spezielle Puffer mit längeren Inkubationszeiten erforderlich, oder Proben müssen eine Bildaufnahme durchlaufen, bevoreinanderer Fleck angewendet wird 4,5,7,9,10,11. Hier zeigen wir eine einfache Methode mit einem weniger komplizierten Verfahren und einem gemeinsamen Puffer für Mikrowellen-vermittelte Antigenabruf in Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung. Obwohl diese Methode die meisten Kreuzreaktivität eliminiert, Benutzer sollten sich einer möglichen schwachen falschen Kolokalisierung bewusst sein, die mit einigen Antikörpern auch nach einer 20 min Mikrowellenbehandlung beobachtet wird.
Endogenes Biotin kann als Marker für steroidogene Zellen in der Nebennierenrinde12verwendet werden. Streptavidin-konjugiertes Fluorophor allein reicht aus, um endogenes Biotin zu detektieren und beleuchtet die gesamte Nebennierenrinde, insbesondere in gefrorenen Abschnitten. Da endogenes Biotin in der Regel in FFPE-Proben blockiert wird, wird das Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren (d. h. ABC-Kit) immer noch häufig verwendet, um Ziele in FFPE-Nebennierenproben zu verstärken. Es ist wichtig zu beachten, dass der Antigen-Retrieval-Schritt auch endogenes Biotin entlarvt und seine Immunaktivitätinduziert 13. Da unsere Methode Mikrowellen-vermittelte Antigen-Retrieval und die Verwendung von streptavidin-konjugiertem HRP kombiniert, ist es möglich, dass endogenes Biotin zu falsch positiven Signalen führt, insbesondere in Geweben, die reich an endogenes Biotin sind (z. B. Leber, Nieren und einige Tumoren)13. Wenn das Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren erforderlich ist, um das Signal zu verstärken, kann ein zusätzlicher Blockierungsschritt wie die Vorinkubation mit freiem Avidin und freiem Biotin dazu beitragen, das endogene Biotinsignal14zu reduzieren. Während unsere Methode einen niedrigen endogenen Biotin-Hintergrund auf FFPE-Maus-Adrenals bietet, ist es wichtig, bei Verwendung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahrens immer eine negative Kontrolle mit jeder Probe einzuschließen. Der alternative Ansatz besteht darin, anstelle des biotinylierten Sekundärantikörpers einen peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper zu verwenden.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Mikrowellenbehandlung mit einem Citratpuffer eine nützliche Methode zur Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung ist. Es ist jedoch zu beachten, dass nicht alle Cross-Re-Aktivitäten vollständig blockiert werden können. Eine schwache falsche Kolokalisierung ist möglich. Dieses Protokoll kann als alternativer Ansatz verwendet werden, wenn keine geeignete Kombination von primären Antikörpern verschiedener Wirtsarten verfügbar ist. Anwender sollten sich über mögliche falsch positive aus der verbleibenden Kreuzreaktivität sowie das wiedergewonnene endogene Biotin im Klaren sein. Richtige Negativkontrollen sollten jederzeit einbezogen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von NIH R00 HD032636 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
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