マウス副腎のマルチプレックス免疫染色のためのマイクロウェーブおよび蛍光色素-Tyramide - 同じ宿主種からの非共役一次抗体を使用
Summary
同じ宿主種からの一次抗体を用いた多重免疫染色に対して、いくつかの異なる方法が確立されている。ここでは、ホルマリン固定パラフィン組み込みマウス副腎切片でのマルチプレックス免疫染色中の抗体クロス反応性を遮断するためのマイクロ波媒介抗体ストリッピングおよびフルオロフォア・チラミドの使用について説明する。
Abstract
免疫染色は、与えられたタンパク質の細胞発現パターンを示す生物医学研究で広く使用されている。多重免疫染色は、複数の一次抗体を使用して標識を可能にします。抗体の交差反応性を最小限に抑えるために、間接染色を用いた多重免疫染色には、異なる宿主種からの標識されていない一次抗体が必要です。しかしながら、異なる種抗体の適切な組合せは、必ずしも利用可能とは限らない。ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)マウス副腎切片に対する多重免疫蛍光に対して、同じ宿主種からの非標識一次抗体(例えば、この場合は両方の抗体がウサギ由来)を用いる方法を説明する。この方法は、抗原検索ステップで使用された同じ手順と試薬を用いて、前染色された一次抗体複合体の活性を取り除く。スライドは、一般的な免疫染色プロトコルを使用して第1一次抗体を染色し、その後にビオチン化二次抗体との結合ステップを行った。次に、フッ素動素を基質として、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼシグナル現像法を用いた。第1次抗体複合体の免疫活性を、8分間のマイクロ波沸騰クエン酸ナトリウム溶液に浸漬して剥ぎ取った。不溶性の蛍光素体の沈着はサンプル上に残り、スライドを他の一次抗体で染色することができた。この方法は、ほとんどの偽陽性シグナルを排除しますが、抗体の交差反応性の背景が残る可能性があります。サンプルが内因性ビオチンで濃縮される場合、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用してビオチン化二次抗体を置換し、回収された内因性ビオチンからの偽陽性を回避することができる。
Introduction
多重免疫染色では、結合された一次抗体を用いた直接染色は有益な結果を提供することができる。二次抗体を使用しない場合、直接染色法は抗体交差反応性からの偽の共局在化シグナルのリスクが低い。しかし、一次抗体上の共役レポーター(フルオロフォア、酵素)またはビオチンは、その将来の使用を制限する。あるいは、間接免疫染色は、通常、標識された二次抗体を有する非共役一次抗体を用いてより強いシグナルを提供する。理想的には、多重免疫染色に使用される非共役一次抗体は、抗体交差反応性を回避するために異なる宿主種から来るべきである。しかしながら、異なる宿主種からの一次抗体の適切な組み合わせは、必ずしも利用可能とは限らない。
望ましくない一次抗体と反応する二次抗体のリスクを排除するために、いくつかの方法が確立されている。一般的な方法の1つは、第2一次抗体1で染色する前に、第1次抗体複合体上の残りの結合エピトープを遮断するF(ab)単量体抗体の使用である。抗体ストリッピングは、ウェスタンブロットシートのストリップおよび再プローブと類似しており、3,3′-ジアミノベンジドテトラヒドロリド(DAB)2および蛍光性チラミド堆積物3等の検出可能なレポーター分子の沈着を剥離することなく、以前染色した抗体複合体を除去する。この方法では、異なる色のレポーター分子が同じスライド上で多重結果を示すことができます。また、多重染色は、抗体の前に堆積した層を完全に除去し、その後に他の抗体から取得した画像のアライメントによっても達成可能である4、5。これらの方法はすべて信頼性の高い結果を得ることができますが、各方法には制限があり、複雑な手順または特別なイメージングシステムが必要です。
本プロトコルは、一般に利用可能な緩衝液を用いて抗体ストリッピング法を適用することを示す。このプロトコルは、同じホスト種からの2つの未標識一次抗体を有するホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)マウス副腎セクションに対して多重免疫蛍光染色を行うために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
多重免疫染色は、2種以上の抗原の細胞共局在を調べるのに有用である。この広く使用されている技術は、一次抗体が異なるレポーター(直接染色)と共役する際に説得力のある共局在化結果を与えます。しかし、直接染色は通常、一次抗体を検出するために結合された二次抗体を含む間接染色と比較して弱いシグナルを提供する。間接染色において、高品質の多重免疫染色結果は、二次抗体が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH R00 HD00 HD032636 によってサポートされています。
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
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