Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes
Summary
L’obtention d’une population pure de fibroblastes est cruciale pour étudier leur rôle dans la réparation des plaies et la fibrose. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés suivis par la caractérisation de leur pureté et de leur fonctionnalité par immunofluorescence, RTPCR, tri cellulaire assisté par fluorescence, et contraction du gel de collagène.
Abstract
La fibrose cardiaque en réponse aux dommages est une réponse physiologique à la cicatrisation des plaies. Des efforts ont été faits pour étudier et cibler les sous-types de fibroblastes qui atténuent la fibrose. Cependant, la recherche sur le fibroblaste a été entravée en raison de l’absence de marqueurs fibreblastaux universellement acceptables pour identifier les fibroblastes quiescents ainsi que les fibroblastes activés. Les fibroblastes sont une population de cellules hétérogènes, ce qui les rend difficiles à isoler et à caractériser. Le protocole présenté décrit trois méthodes différentes pour enrichir les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés. L’utilisation d’un protocole standard et fiable pour isoler les fibroblastes permettra d’étudier leurs rôles dans l’homéostasie ainsi que la modulation de la fibrose.
Introduction
Les fibroblastes cardiaques, cellules d’origine mésenchymale, jouent un rôle important dans le maintien de la conduction électrique et des forces mécaniques dans le cœur en plus du maintien de l’architecture cardiaque pendant l’homéostasie1. Suite à des blessures, ces cellules sont activées, se dilatent et produisent des protéines de matrice extracellulaire (ECM)2. De nombreuses études précliniques ont révélé des fibroblastes en tant que régulateurs cellulaires critiques qui maintiennent l’intégrité structurale d’un cœur blessé3 ainsi que les cellules principales effecteur responsables de la production non contrôlée et le dépôt des protéines ECM, résultant en la formation de cicatrices raides et l’insuffisance cardiaque4. Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, ce qui rend difficile de disséquer leur fonction réparatrice à partir de propriétés maladaptives pro-fibrotiques. Récemment, l’hétérogénéité fonctionnelle de deux sous-types fibreblastiques distincts suivant des dommages myocardiques ont été définies, indiquant la possibilité d’isoler différents sous-types de fibroblaste et d’étudier leur rôle dans la cicatrisation des plaies5.
L’obtention d’une population de fibroblastes purs est cruciale pour délimiter son rôle fonctionnel dans la réparation et la fibrose. Cependant, la présence de marqueurs fibroblastiques multiples qui reconnaissent d’autres types de cellules font qu’il est difficile d’isoler une population fibreuse sensiblement pure6. Plusieurs études élégantes ont conçu des moyens intelligents d’isoler les fibroblastes cardiaques du myocarde non blessé et blessé. La méthode la plus populaire et bien établie d’enrichir les fibroblastes est par l’adhérence sélective suivant la digestion des tissus enzymatiques7.
En outre, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des fibroblastes à base d’antigènes de surface cellulaire a été décrit avec succès8. Dans l’étude, suivant la digestion enzymatique, les cellules mésenchymales ont été triées comme lignée-négative (Lin : Ter119–CD45–CD31–) et gp38-positive (gp38–) des coeurs de souris. Les cellules de Gp38ont été confirmées pour être des fibroblastes basés sur leur co-expression de col1-1 et d’autres marqueurs mésenchymals. Bien que la plupart de la digestion des tissus est terminée après avoir disséqué le ventricule dans un plat Petri, une étude récente a étudié l’utilisation d’une perfusion directe d’enzyme d’aiguille du ventricule gauche pour isoler les myocytes et les non-myocytes qui incluent les fibroblastes9. Les fibroblastes ont ensuite été isolés par l’adhérence sélective dans ce cas.
Ce protocole décrit l’isolement et l’enrichissement des fibroblastes à l’aide de trois méthodes. La première est une méthode déjà établie impliquant l’adhérence sélective des fibroblastes suivant la digestion enzymatique. La deuxième méthode est utilisée principalement pour isoler les muscles lisses alpha induits par les blessures exprimant des myofibroblastes. La troisième méthode implique l’épuisement séquentiel et magnétique d’une suspension de cellules cardiaques enzyme-digérées des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Après épuisement, les fibroblastes/myofibroblastes sont isolés en fonction de la présence de l’antigène MEFSK4 à l’aide de perles magnétiques. Récemment, MEFSK4 a été décrit comme un antigène présent sur les fibroblastes quiescents ainsi que activés, ce qui en fait un marqueur approprié pour l’identification et l’isolement de fibroblaste. Naturellement, toutes les méthodes décrites ici ont des limites uniques. Il est donc fortement recommandé de vérifier la pureté de la population cellulaire isolée par analyse de flux, immunostaining, et semi-quantitative PCR en temps réel. Cependant, ces méthodologies peuvent être élargies, et des marqueurs supplémentaires peuvent être ajoutés afin d’exclure d’autres populations contaminantes avant d’utiliser les populations de fibroblastes et de myofibroblastes pour des expériences cruciales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, identifiée par divers ensembles de marqueurs. Les marqueurs protéiques qui ont été utilisés pour identifier les fibroblastes sont le récepteur du domaine de la discoïtine 2 (DDR2), la fibronectine, la vimentine, le collagène I et III, et Thy115,16,17,18,19,20….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs veulent remercier le Dr Ivo Kalajzic pour les souris de la SMA-GFP. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sous le numéro de prix R21EB019509 (P.P.Y.), et la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association sous le numéro de prix 17SDG33630187 (S.S.). Des analyses de cytométrie de débit ont été effectuées au VUMC Flow Cytometry Shared Resource, qui est soutenu par le Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) et le Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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