Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos
Summary
La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.
Abstract
La fibrosis cardíaca en respuesta a una lesión es una respuesta fisiológica a la cicatrización de heridas. Se han hecho esfuerzos para estudiar y atacar los subtipos de fibroblastos que mitigan la fibrosis. Sin embargo, la investigación de fibroblastos se ha visto obstaculizada debido a la falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceptables para identificar fibroblastos en reposo y activados. Los fibroblastos son una población de células heterogéneas, lo que dificulta su aislamiento y caracterización. El protocolo presentado describe tres métodos diferentes para enriquecer los fibroblastos y los miofibroblastos de los corazones de ratón no lesionados y heridos. El uso de un protocolo estándar y fiable para aislar los fibroblastos permitirá el estudio de sus funciones en la homeostasis, así como la modulación de la fibrosis.
Introduction
Los fibroblastos cardíacos, células de origen mesenquimal, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la conducción eléctrica y las fuerzas mecánicas en el corazón, además del mantenimiento de la arquitectura cardíaca durante la homeostasis1. Después de la lesión, estas células se activan, se expanden y producen proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muchos estudios preclínicos han revelado fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantienen la integridad estructural de un corazón lesionado3, así como las principales células efectoras responsables de la producción y deposición sin control de proteínas ECM, lo que resulta en la formación de cicatrices rígidas y la insuficiencia cardíaca4. Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, lo que hace difícil diseccionar su función reparadora de las propiedades de la maladaptiveificación profibrosca. Recientemente, se ha definido la heterogeneidad funcional de dos subtipos de fibroblastos distintos después de una lesión miocárdica, lo que indica la posibilidad de aislar diferentes subtipos de fibroblastos y estudiar su papel en la cicatrización de heridas5.
La obtención de una población de fibroblastos puros es crucial para delinear su papel funcional en la reparación y la fibrosis. Sin embargo, la presencia de múltiples marcadores de fibroblastos que reconocen otros tipos de células hacen que sea difícil aislar a una población de fibroblastos sustancialmente pura6. Varios estudios elegantes han ideado formas inteligentes de aislar fibroblastos cardíacos de miocardio no lesionado y lesionado. El método más popular y bien establecido de fibroblastos enriquecedores es a través de la adhesión selectiva después de la digestión del tejido enzimático7.
Además, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de fibroblastos a base de antígenos de superficie celular se ha descrito con éxito8. En el estudio, después de la digestión enzimática, las células mesenquimales se clasificaron como negativos de linaje (Lin: Ter119–CD45–CD31)y gp38-positivo (gp38+) de los corazones del ratón. Se confirmó que las células Gp38+ve eran fibroblastos en función de su coexpresión de col1-1 y otros marcadores mesenquimales. Aunque la mayoría de la digestión tisular se completa después de disección del ventrículo en una placa de Petri, un estudio reciente ha investigado el uso de una perfusión directa de la enzima aguja del ventrículo izquierdo para aislar los miocitos y los no miocitos que incluyen fibroblastos9. Los fibroblastos fueron aislados por adhesión selectiva en este caso.
Este protocolo describe el aislamiento y el enriquecimiento de los fibroblastos utilizando tres métodos. El primero es un método ya establecido que implica la adhesión selectiva de fibroblastos después de la digestión enzimática. El segundo método se utiliza para aislar principalmente el músculo liso alfa inducido por lesiones que expresa miofibroblastos. El tercer método consiste en el agotamiento secuencial y magnético de una suspensión celular cardíaca digerida enzimática de células hematopoyéticas y endoteliales. Tras el agotamiento, los fibroblastos/miofibroblastos se aíslan en función de la presencia del antígeno MEFSK4 utilizando perlas magnéticas. Recientemente, MEFSK4 ha sido descrito como un antígeno presente en fibroblastos inactivos y activados, por lo que es un marcador adecuado para la identificación y aislamiento de fibroblastos. Naturalmente, todos los métodos descritos aquí tienen limitaciones únicas. Por lo tanto, es muy recomendable comprobar la pureza de la población celular aislada mediante análisis de flujo, inmunomanchay y PCR semicuantitativo en tiempo real. Sin embargo, estas metodologías se pueden ampliar, y se pueden agregar marcadores adicionales con el fin de excluir otras poblaciones contaminantes antes de utilizar las poblaciones de fibroblastos y miofibroblastos para experimentos cruciales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, identificado por un conjunto diverso de marcadores. Los marcadores proteicos que se han utilizado para identificar fibroblastos son el receptor 2 de dominio de discoidina (DDR2), la fibronectina, la vimentina, el colágeno I y III, y El Thy115,,16,17,18,19,20. Mientras q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren dar las gracias al Dr. Ivo Kalajzic por los ratones de la SMA-GFP. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el Número de Premio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagen Biomédica y Bioingeniería del NIH bajo el Número de Premio R21EB019509 (P.P.Y.), y la Beca de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón bajo el Premio Número 17SDG33630187 (S.S.). Los análisis de citometría de flujo se realizaron en el recurso compartido de citometría de flujo VUMC, que cuenta con el apoyo del Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) y el Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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