Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu
Summary
Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.
Abstract
Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.
Introduction
Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleriüretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur3 yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan4. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığıgösterilmiştir 5.
Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblastpopülasyonu 6izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini7takiben seçici yapışma yoluyla 7.
Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir8. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119−CD45−CD31− )ve gp38-pozitif (gp38+) olarak sıralandı. Gp38+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı9. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.
Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy115,16,17,18,19,20. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Ivo Kalaycı’ya αSMA-GFP fareleri için teşekkür etmek istiyorlar. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIH) tarafından R01GM118300 (S.S.), Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve BIYOmühendislik Enstitüsü (S.S.) altında desteklenmiştir. Ödül Numarası R21EB019509 (P.P.Y.) ve Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Hibe si 17SDG33630187 (S.S.) altında. Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenen VUMC Flow Sitometri Ortak Kaynak’ta akış sitometrisi analizleri yapıldı.
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
