엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시
Summary
유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.
Abstract
맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.
여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.
Introduction
생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다1,,2,,3,,4,,5. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.
다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에 민감한 엘라스틴과 같은 단백질 (ELP)과 같은 양과 성 단백질을 포함5,8,9, 재조합 올레오신10및 인공 단백질 양서류11. 온도 트리거 방법은 미셀의 조립을 주도하고있다4,10,12섬유13시트14및 소포9,15,16. 유기 용매와 관련된 방법은 동적 단백질 기반 소포의 형성을 위해 적용되었습니다.8,11,14. 지금까지 소포 형성을 위한 응용 프로토콜은 마이크로미터 크기의 어셈블리에 대한 조립 제어가 부족한 경우가 많습니다.16,17또는 조립 수율이 제한되어 있습니다.5. 또한, 일부 보고 ELP 기반 소포 는 캡슐화 잠재력을 손상12또는 시간이 지남에 따라 제한된 안정성9. 이러한 단점을 해결하는 제시된 프로토콜은 뚜렷한 물리화학적 특성, 양호한 캡슐화 잠재력 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조의 자체 조립을 가능하게 합니다. 맞춤형 양서류 ELP는 구형 응고체와 고도로 주문된 꼬인 섬유 번들에서 적용된 프로토콜 및 관련 환경 조건에 따라 unilamellar 소포에 이르기까지 다양한 범위의 상분자 구조로 조립됩니다. 큰 수피 단백질 막 기지를 둔 구획 (PMBC)는 리포좀과 유사한 막 융합 및 상 분리 행동과 같은 모든 주요 표현형을 밝힙니다. PMBC는 간단한 epifluorescence 현미경 검사법을 사용하여 모니터링할 수 있는 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 효율적으로 캡슐화합니다. 이 연구에서 사용되는 반복적 인 ELP 도메인은 단백질 기반의 초분자 아키텍처를위한 매력적인 빌딩 블록입니다.18. ELP 펜타펩타이드 반복 유닛(VPGVG)은 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서 네 번째 위치(발린, V)에서 프롤린 외에 다른 aa를 견딜 수 있는 것으로 알려져 있습니다.19. 특유의 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양과성 ELP의 설계는 뚜렷한 소수성, 극성 및 전하를 가진 VPGXG 반복에 aa 게스트 잔류물 (X)을 삽입함으로써 실현되었습니다.20. 친수성 도메인이 충전된 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)을 게스트 잔류물로 함유하는 동안 소수성 페닐알라닌(F) 또는 이솔루신(I)을 구비한 양과성 ELP 도메인. 적격 한 양과 성 ELP 구문 및 해당 aa 시퀀스의 목록은 보충 정보 및 참조에서 찾을 수 있습니다.8,21. 형광 현미경 검사법을 통해 시각화를 위한 작은 형광 염료 또는 형광 단백질을 갖춘 모든 빌딩 블록. mEGFP 및 기타 형광 단백질은 ELP 양서류의 친수성 도메인에 N-말단 융합되었다. 유기 염료는 구리가 없는 균주를 통해 공액화되었고 알키네-아지드 사이클로아더(SPAAC)를 동시 도입된 부자연 아미노산(UAA)으로 촉진시켰다. UAA의 공동 번역 편입para-아지도페닐알라닌 (파즈프)22친수성 ELP 도메인의 N 말단 수정을 허용합니다. 이에 녹색 형광염료 BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP) 또는 변형된 사이클로크틴을 가진 임의의 작은 형광 분자는 형광 프로브로서 사용될 수 있다. UAA pAzF의 성공적인 통합과 SPAAC를 통한 염료의 사이클로추가는 해당 트립틱 펩타이드의 효율적인 이온화로 인해 LC-MS/MS를 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.8. 이 작은 유기 염료는 형광 단백질이 대부분의 유기 용매와 호환되지 않으므로 조립 프로토콜에 대한 용매 선택을 넓히기 위해 적용되었습니다. 실험실에서 개발된 상분자 구조에 대한 가장 효율적인 조립 프로토콜 2개는 아래에 설명되어 있습니다. THF 팽윤 방법은 유기 염료 변형 양과성 ELP와만 호환됩니다. 대조적으로, 1-부탄올(BuOH) 압출 방법은 형광 프로브와 같은 많은 단백질과 호환되며, 예를 들어 mEGFP, 기재된 방법은 이들 융합 단백질의 형광을 완전히 보존하기 때문이다. 또한, 소분자 및 수혈융합 거동을 캡슐화하는 것은 BuOH 압출 방법을 채택함으로써 가장 잘 작동한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.
양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 재정 지원을 위한 BMBF및 생물학 시스템 분석 센터 (ZBSA)를 위한 연구 시설을 제공하기위한 감사합니다. 우리는 P. G. 슐츠, TSRI, 라 호야, 캘리포니아, 플라스미드 pEVOL-pAzF를 제공에 감사드립니다. 우리는 알버트 루드비히스 대학 프라이부르크의 생물 학적 시스템 분석 센터 (ZBSA)의 생명 이미징 센터 (LIC)의 직원에게 공초점 현미경 자원에 대한 도움과 이미지 기록에 대한 탁월한 지원에 감사드립니다.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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