Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu
Summary
Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.
Abstract
Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.
Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP’lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP’lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC’ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.
Introduction
Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik polimerlerle karşılaştırıldığında, proteinaceous yapı taşları genetik düzeyde acil supramoleküler yapılar6 üzerinde hassas kontrol sağlar. Bireysel protein yapı taşlarının birincil amino asit (aa) dizisi, molekülerden makroskopik düzeye kadar olan montaj potansiyeline yönelik bilgileri ve son supramoleküler yapının üç boyutlu şekli ve fiziksel özelliklerini özünde kodlar7.
Farklı supramoleküler yapıların biraraya toplanması için bildirilen yöntemler genellikle ısıya duyarlı elastin benzeri proteinler (ELP) gibi amfilik proteinleri içerir.5,8,9, rekombinant oleosin10ve yapay protein amphiphiles11. Sıcaklık tetiklenen yöntemler misellerin montajına yol açmıştır4,10,12Lif13Yaprak14ve veziküller9,15,16. Dinamik protein bazlı veziküllerin oluşumu için organik çözücüler içeren yöntemler uygulanmıştır.8,11,14. Şimdiye kadar, vezikül oluşumu için uygulanan protokoller genellikle mikrometre büyüklüğündeki montajlar üzerinde montaj kontrolü eksikliği16,17veya sınırlı montaj verime sahip5. Buna ek olarak, rapor edilen bazı ELP bazlı veziküller kapsülleme potansiyelini bozmuş12veya zaman içinde sınırlı stabilite9. Sunulan protokoller, bu sakıncaları ele alarak, farklı fizyokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme potansiyeline ve uzun süreli stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıların kendi kendine biraraya getirilmesini sağlar. Özel ampifilik ELP’ler, uygulanan protokol ve ilgili çevre koşullarına bağlı olarak küresel koaservatlar ve yüksek derecede sıralanmış bükümlü lif demetlerinden unilamellar veziküllere kadar geniş bir yelpazeyi kapsayan supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Büyük vesiküler Protein Membran Esaslı Bölmeler (PMBC) membran füzyonu ve faz ayırma davranışı gibi tüm ana fenotipleri lipozomlara benzer olarak ortaya koymaktadır. PMBC’ler, basit epifloresan mikroskobu kullanılarak izlenebilen kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini etkin bir şekilde kapsüllerler. Bu çalışmada kullanılan tekrarlayan ELP alanları protein bazlı supramoleküler mimariler için çekici yapı taşlarıdır.18. ELP pentapeptid tekrar ünitesi (VPGVG) yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korurken, dördüncü pozisyonda proline (valine, V) dışında farklı aa tolere bilinmektedir19. Farklı hidrofilik ve hidrofobik etki alanları içeren amfilik ELP’lerin tasarımı, VPGXG’ye farklı hidrofobiklik, polarite ve şarj ile aa konuk kalıntıları (X) yerleştirilerek gerçekleştirildi.20. Hidrofilik etki alanı misafir kalıntısı olarak yüklü glutamik asit (E) veya arginin (R) içererken, hidrofobik fenilalanin (F) veya izolösin (I) ile donatılmış amfilik ELP etki alanları. Uygun amfilik ELP yapıları ve ilgili aa dizileri listesi ek bilgi ve referanslar bulunabilir8,21. Floresan mikroskopisi ile görselleştirme için küçük floresan boyalar veya floresan proteinler ile donatılmış tüm yapı taşları. mEGFP ve diğer floresan proteinler N-terminalel ELP amphiphiles hidrofilik etki alanlarında erimiş edildi. Organik boyalar bakıriçermeyen suşu ile alkine-azid sikloaddition (SPAAC) ile eş-çeviriile doğal olmayan amino asit (UAA) ile konjuge edildi. UAA’nın ortak çevirisipara-azidophenylalanine (pAzF)22hidrofilik ELP etki alanının N-terminal modifikasyonuna izin verir. Bu şekilde yeşil floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) veya süzme siklotine sahip herhangi bir küçük floresan molekül floresan prob olarak kullanılabilir. UAA pAzF’in başarılı bir şekilde eklenmesi ve boyanın SPAAC ile sikloeklenmesi, ilgili triptik peptidlerin verimli iyonizasyonu nedeniyle LC-MS/MS ile kolayca doğrulanabilir.8. Floresan proteinler çoğu organik çözücüile uyumsuz olduğundan, bu küçük organik boya montaj protokolleri için çözücü seçimini genişletmek için uygulanmıştır. Laboratuarımızda geliştirilen supramoleküler yapılar için en verimli iki montaj protokolü aşağıda açıklanmıştır. THF şişme yöntemi sadece organik boya modifiye amfilik ELP ile uyumludur. Buna karşılık, 1-butanol (BuOH) ekstrüzyon yöntemi floresan prob gibi birçok protein ile uyumludur, örneğin mEGFP, açıklanan yöntem bu füzyon proteinlerinin floresansını tamamen koruduğundan. Buna ek olarak, küçük moleküllerin kapsülleme ve vesiküler füzyon davranışı En iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi istihdam çalışır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:
Amfilik ELP’nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C’lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP’nin başarılı afinite dayalı saflaşmas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mali destek için BMBF ve Biyolojik Sistemler Analizi Merkezi (ZBSA) araştırma tesisi sağlamak için teşekkür ederiz. Biz Plazmid pEVOL-pAzF sağlamak için P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, ABD müteşekkiriz. Albert-Ludwigs-University Freiburg Biyolojik Sistem Analizi Merkezi’ndeki (ZBSA) Yaşam Görüntüleme Merkezi (LIC) personeline konfokal mikroskopi kaynakları ve görüntü kaydındaki mükemmel destek için teşekkür ederiz.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
