Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro
Summary
Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC’s) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.
Abstract
Op maat gemaakte eiwithoudende bouwstenen zijn veelzijdige kandidaten voor de assemblage van supramoleculaire structuren zoals minimale cellen, drugsafgiftevoertuigen en enzymsteigers. Door hun biocompatibiliteit en tuniekheid op genetisch niveau zijn Elastin-achtige eiwitten (ELP) ideale bouwstenen voor biotechnologische en biomedische toepassingen. Niettemin blijft de assemblage van op eiwitten gebaseerde supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen en een goed inkapselingspotentieel een uitdaging.
Hier bieden we twee efficiënte protocollen voor begeleide zelfassemblage van amfifiele ELPs in supramoleculaire eiwitarchitecturen zoals sferische coacervates, vezels en stabiele blaasjes. De gepresenteerde assemblageprotocollen genereren Protein Membrane-Based Compartments (PMBC’s) op basis van ELP’s met aanpasbare fysisch-chemische eigenschappen. PMBC’s vertonen fasescheidingsgedrag en onthullen methodeafhankelijke membraanfusie en zijn in staat om chemisch diverse fluorescerende ladingmoleculen in te kapselen. De resulterende PMBC’s hebben een hoog toepassingspotentieel als een medicijnformulerings- en leveringsplatform, kunstmatige cel en gecompartimenteerde reactieruimte.
Introduction
De assemblage van supramoleculaire structuren voor biotechnologische toepassingen wordt steeds belangrijker1,2,3,4,5. Voor de assemblage van functionele architecturen zoals coacervates, blaasjes en vezels met de gewenste fysisch-chemische eigenschappen is het belangrijk om de fysicochemische en conformatie-eigenschappen van de componenten te begrijpen en te controleren. Door de moleculaire precisie van moleculen in de natuur zijn bouwstenen voor supramoleculaire structuren steeds meer gebaseerd op lipiden, nucleïnezuren of eiwitten. In vergelijking met synthetische polymeren zorgen eiwithoudende bouwstenen voor nauwkeurige controle over opkomende supramoleculaire structuren6 op genetisch niveau. De primaire aminozuur (aa) sequentie van de afzonderlijke eiwitbouwstenen codeert intrinsiek de informatie voor hun assemblagepotentieel van het moleculaire tot het macroscopische niveau, evenals de driedimensionale vorm en fysische eigenschappen van de uiteindelijke supramoleculaire structuur7.
Gemelde methoden voor de assemblage van verschillende supramoleculaire structuren bevatten vaak amfifiele eiwitten zoals temperatuurgevoelige elastine-achtige eiwitten (ELP)5,8,9, recombinant oleosine10en kunstmatige eiwitfifielen11. Temperatuur geactiveerde methoden hebben geleid tot de assemblage van micelles4,10,12Vezels13Bladen14en blaasjes9,15,16. Methoden met organische oplosmiddelen zijn toegepast voor de vorming van dynamische eiwitgebaseerde blaasjes8,11,14. Tot nu toe, toegepaste protocollen voor blaasvorming vaak gebrek aan montage controle over micrometer formaat assemblages16,17of hebben een beperkte montage opbrengst5. Bovendien hebben sommige gemelde elp-gebaseerde blaasjes een verminderde inkapselingspotentieel12of beperkte stabiliteit in de tijd9. Het aanpakken van deze nadelen, de gepresenteerde protocollen in staat stellen de zelfassemblage van micrometer en sub micrometer formaat supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen, goede inkapseling potentieel en lange tijd stabiliteit. Op maat gemaakte amfifiele ELP’s assembleren zich in supramoleculaire structuren, verspreid over het bereik van sferische coacervates en zeer geordende gedraaide vezelbundels tot unilamellaire blaasjes, afhankelijk van het toegepaste protocol en de bijbehorende omgevingsomstandigheden. Grote voertuigen op basis van eiwit membraan compartimenten (PMBC) onthullen alle belangrijke fenotypes zoals membraan fusie en fase scheiding gedrag analoog aan liposomen. PMBCs efficiënt inkapselen chemisch diverse fluorescerende lading moleculen die kunnen worden gecontroleerd met behulp van eenvoudige epifluorescentie microscopie. De repetitieve ELP domeinen die in deze studie worden gebruikt zijn aantrekkelijke bouwstenen voor eiwitgebaseerde supramoleculaire architecturen18. Van de ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG) is bekend dat het andere aa tolereert naast proline op de vierde positie (valine, V), met behoud van de structurele en functionele eigenschappen19. Het ontwerp van amfifiele ELPs met kenmerkende hydrofiele en hydrofobe domeinen werd gerealiseerd door het inbrengen van aa gastresiduen (X) in de VPGXG herhaling met duidelijke hydrofobe, polariteit en lading20. Amfifiele ELP-domeinen die zijn uitgerust met hydrofobe fenylalanine (F) of isoleucine (I), terwijl het hydrofiele domein geladen glutaminezuur (E) of arginine (R) als gastresiduen bevatte. Een lijst van in aanmerking komende amfifiele ELP-constructies en overeenkomstige aa-sequenties is te vinden in de aanvullende informatie en referenties8,21. Alle bouwstenen waren voorzien van kleine fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende eiwitten voor visualisatie via fluorescentiemicroscopie. mEGFP en andere fluorescerende eiwitten werden N-terminaal gefuseerd met de hydrofiele domeinen van de ELP-amfifielen. Organische kleurstoffen werden geconjugeerd via kopervrije stam bevorderd alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) tot een co-translationeel geïntroduceerd onnatuurlijk aminozuur (UAA). De co-translationele integratie van de UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22staat de N-terminal modificatie van het hydrofiele ELP-domein toe. Op deze manier de groene fluorescerende kleurstof BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) of een klein fluorescerend molecuul met een gespannen cyclooctyne kan worden gebruikt als fluorescerende sonde. Succesvolle integratie van de UAA pAzF en cycloaddition van de kleurstof via SPAAC kan gemakkelijk worden bevestigd via LC-MS / MS als gevolg van efficiënte ionisatie van de overeenkomstige tryptische peptiden8. Deze kleine organische kleurstof werd toegepast om de oplosmiddelkeuze voor assemblageprotocollen te verbreden, aangezien fluorescerende eiwitten onverenigbaar zijn met de meeste organische oplosmiddelen. De twee meest efficiënte assemblageprotocollen voor supramoleculaire structuren die in ons lab zijn ontwikkeld, worden hieronder beschreven. De THF zwelling methode is alleen compatibel met organische kleurstof gemodificeerde amfifiele ELP. De extrusiemethode 1-butanol (BuOH) is daarentegen compatibel met veel eiwitten als fluorescerende sonde, bijvoorbeeld mEGFP, omdat de beschreven methode de fluorescentie van deze fusie-eiwitten volledig behoudt. Bovendien werkt de inkapseling van kleine moleculen en vesiculatiegedrag het beste door gebruik te maken van de BuOH extrusiemethode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een fout bij het volgen van de beschreven protocollen voor de assemblage van gedefinieerde supramoleculaire structuren leidt voornamelijk tot de vorming van niet-specifieke aggregaten(figuur 2, IV) of tot homogeen verdeelde ELP-amfifielen. Kritieke stappen van het protocol worden hieronder besproken:
Voor een hoge expressieopbrengst van de amfifiele ELP is een relatief lage temperatuur van 20°C optimaal. Voor een succesvolle affiniteitsgebaseerde zuivering van de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de BMBF voor financiële steun en het Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) voor het verstrekken van de onderzoeksfaciliteit. We zijn P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californië, VS dankbaar voor het verstrekken van de plasmid pEVOL-pAzF. Wij danken de medewerkers van het Life Imaging Center (LIC) in het Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) van de Albert-Ludwigs-University Freiburg voor hulp met hun confocale microscopie middelen, en de uitstekende ondersteuning bij beeldopname.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
