Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro
Summary
Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.
Abstract
Blocos de construção protecários sob medida são candidatos versáteis para a montagem de estruturas supramoleculares, como células mínimas, veículos de entrega de drogas e andaimes enzimáticos. Devido à sua biocompatibilidade e sintonia no nível genético, as proteínas semelhantes à Elastina (ELP) são blocos de construção ideais para aplicações biotecnológicas e biomédicas. No entanto, a montagem de estruturas supramoleculares baseadas em proteínas com propriedades fisioquímicas distintas e bom potencial de encapsulamento permanece desafiadora.
Aqui fornecemos dois protocolos eficientes para a auto-montagem guiada de ELPs anfífilos em arquiteturas de proteínasupramolecular, tais como coacervates esféricos, fibras e vesículas estáveis. Os protocolos de montagem apresentados geram compartimentos à base de membrana siproteica (PMBCs) baseados em ELPs com propriedades físico-químicas adaptáveis. Os PMBCs demonstram o comportamento de separação de fase e revelam a fusão de membranadependente do método e são capazes de encapsular moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Os PMBCs resultantes têm um alto potencial de aplicação como uma plataforma de formulação e entrega de medicamentos, células artificiais e espaço de reação compartimentado.
Introduction
A montagem de estruturas supramoleculares para aplicações biotecnológicas está se tornando cada vez mais importante1,2,3,4,5. Para a montagem de arquiteturas funcionais como coacervates, vesículas e fibras com propriedades físico-químicas desejadas é importante entender e controlar as propriedades físico-químicas e conformacionais dos componentes. Devido à precisão molecular das moléculas encontradas na natureza, os blocos de construção para estruturas supramoleculares são cada vez mais baseados em lipídios, ácidos nucleicos ou proteínas. Em comparação com polímeros sintéticos, blocos de construção proteináceos permitem um controle preciso sobre estruturas supramoleculares emergentes6 no nível genético. A seqüência de aminoácidos primários (aa) dos blocos individuais de construção de proteínas codifica intrinsecamente as informações para o seu potencial de montagem desde o nível molecular até o nível macroscópico, bem como a forma tridimensional e as propriedades físicas da estrutura supramolecular final7.
Métodos relatados para a montagem de diferentes estruturas supramoleculares geralmente envolvem proteínas anfífilas, como proteínas sensíveis à temperatura semelhantes à elastina (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10e anfífilos de proteína artificial11. Métodos acionados de temperatura levaram à montagem de micelas4,10,12Fibras13Folhas14e vesículas9,15,16. Métodos envolvendo solventes orgânicos têm sido aplicados para a formação de vesículas dinâmicas à base de proteínas8,11,14. Até agora, protocolos aplicados para a formação de vesículas muitas vezes não têm controle de montagem sobre conjuntos de tamanho de micrômetros16,17ou têm rendimento de montagem limitado5. Além disso, algumas vesículas baseadas em ELP relataram ter prejudicado o potencial de encapsulamento12ou estabilidade limitada ao longo do tempo9. Abordando essas desvantagens, os protocolos apresentados permitem a automontagem de estruturas supramoleculares de micromedidor e submicrometro com propriedades fisioquímicas distintas, bom potencial de encapsulamento e estabilidade de longo prazo. Os ELPs anfífilos sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares, abrangendo a faixa desde coacervates esféricos e feixes de fibras torcidas altamente ordenados até vesículas unilamelares, dependendo do protocolo aplicado e das condições ambientais associadas. Grandes compartimentos à base de membrana sicular (PMBC) revelam todos os principais fenótipos, como fusão de membranas e comportamento de separação de fase análogo a lipossomos. Os PMBCs encapsulam eficientemente moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas que podem ser monitoradas usando microscopia de epifluorescência simples. Os domínios repetitivos de ELP utilizados neste estudo são blocos de construção atraentes para arquiteturas supramoleculares baseadas em proteínas18. A unidade de repetição do pentapeptídeo ELP (VPGVG) é conhecida por tolerar diferentes aa além de prolina na quarta posição (valina, V), preservando suas propriedades estruturais e funcionais19. O desenho de ELPs anfífilos contendo domínios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos foi realizado pela inserção de resíduos aa convidados (X) na repetição vpgxg com hidrofobicidade distinta, polaridade e carga20. Domínios anfífilos de ELP quando equipados com fenilalanina hidrofóbica (F) ou isoleucina (I) enquanto o domínio hidrofílico continha ácido glutamico carregado (E) ou arginina (R) como resíduos convidados. Uma lista de construções anfífilas elegíveis e seqüências aa correspondentes podem ser encontradas nas informações e referências suplementares8,21. Todos os blocos de construção onde equipados com pequenos corantes fluorescentes ou proteínas fluorescentes para visualização via microscopia de fluorescência. mEGFP e outras proteínas fluorescentes foram futilizadas n-terminalmente aos domínios hidrofílicos dos anfífilos ELP . Corantes orgânicos foram conjugados através da cepa livre de cobre promovida cicloadição alquina-azida (SPAAC) a um aminoácido não natural introduzido co-tradução (UAA). A incorporação co-translacional do UAApara-azidophenylanina (pAzF)22permite a modificação n-terminal do domínio eLP hidrofílico. Desta forma, o corante fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou qualquer pequena molécula fluorescente com um ciclooctyne tenso pode ser usado como sonda fluorescente. A incorporação bem sucedida do pAzF da UAA e a cicloadição do tintura via SPAAC podem ser facilmente confirmadas via LC-MS/MS devido à ionização eficiente dos peptídeos tripés correspondentes8. Este pequeno corante orgânico foi aplicado para ampliar a escolha do solvente para protocolos de montagem, uma vez que as proteínas fluorescentes são incompatíveis com a maioria dos solventes orgânicos. Os dois protocolos de montagem mais eficientes para estruturas supramoleculares desenvolvidas em nosso laboratório são descritos abaixo. O método de inchaço THF só é compatível com o ELP anfífila modificado de tintura orgânica. Em contraste, o método de extrusão de 1-butanol (BuOH) é compatível com muitas proteínas como sonda fluorescente, por exemplo, mEGFP, uma vez que o método descrito preserva totalmente a fluorescência dessas proteínas de fusão. Além disso, o encapsulamento de pequenas moléculas e comportamento de fusão vesicular funciona melhor empregando o método de extrusão BuOH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma falha ao seguir os protocolos descritos para a montagem de estruturas supramoleculares definidas leva principalmente à formação de agregados inespecíficos(Figura 2, IV) ou a anfífilos ELP-anfifilos homogeneamente distribuídos. As etapas críticas do protocolo são discutidas abaixo:
Para o alto rendimento de expressão do ELP anfífilo, uma temperatura relativamente baixa de 20°C é ótima. Para a purificação bem-sucedida da eLP anfífila, foi comprov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao BMBF pelo apoio financeiro e ao Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) pelo fornecimento da instalação de pesquisa. Somos gratos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Califórnia, EUA por fornecer o plasmídeo pEVOL-pAzF. Agradecemos à equipe do Centro de Imagens de Vida (LIC) do Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) da Universidade Albert-Ludwigs-Universidade de Freiburg pela ajuda com seus recursos de microscopia confocal, e pelo excelente apoio na gravação de imagens.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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