Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro
Summary
An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.
Abstract
Maßgeschneiderte proteinhaltige Bausteine sind vielseitige Kandidaten für die Montage supramolekularer Strukturen wie Minimalzellen, Wirkstoffabgabefahrzeuge und Enzymgerüste. Aufgrund ihrer Biokompatibilität und Tunabilität auf genetischer Ebene sind Elastin-ähnliche Proteine (ELP) ideale Bausteine für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Dennoch bleibt die Montage von proteinbasierten supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften und gutem Verkapselungspotenzial eine Herausforderung.
Hier bieten wir zwei effiziente Protokolle für die geführte Selbstmontage von amphiphilen ELPs in supramolekulare Proteinarchitekturen wie sphärische Coacervate, Fasern und stabile Vesikel. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) auf Basis von ELPs mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. PMBCs zeigen Phasentrennungsverhalten und zeigen eine methodenabhängige Membranfusion auf und sind in der Lage, chemisch unterschiedliche fluoreszierende Ladungsmoleküle zu verkapseln. Die resultierenden PMBCs haben ein hohes Anwendungspotenzial als Wirkstoffformulierungs- und Abgabeplattform, künstliche Zelle und abgeschotteten Reaktionsraum.
Introduction
Die Montage supramolekularer Strukturen für biotechnologische Anwendungen wird immer wichtiger1,2,3,4,5. Für die Montage von funktionalen Architekturen wie Koacervate, Vesikel und Fasern mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften ist es wichtig, die physikalisch-chemischen und konformen Eigenschaften der Komponenten zu verstehen und zu kontrollieren. Aufgrund der molekularen Präzision von Molekülen in der Natur basieren Bausteine für supramolekulare Strukturen zunehmend auf Lipiden, Nukleinsäuren oder Proteinen. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren ermöglichen proteinhaltige Bausteine eine präzise Kontrolle der entstehenden supramolekularen Strukturen6 auf genetischer Ebene. Die primäre Aminosäure(aa) Sequenz der einzelnen Proteinbausteine kodiert die Informationen für ihr Montagepotential von der molekularen bis zur makroskopischen Ebene sowie die dreidimensionale Form und physikalische Eigenschaften der endgültigen supramolekularen Struktur7.
Gemeldete Methoden zur Montage verschiedener supramolekularer Strukturen beinhalten oft amphiphile Proteine wie temperaturempfindliche Elastin-ähnliche Proteine (ELP)5,8,9, rekombinantes Oleosin10und künstliche Protein-Amphiphilen11. Temperaturausgelöste Methoden haben zur Montage von Mizellen geführt4,10,12Fasern13Blätter14und Vesikel9,15,16. Für die Bildung dynamischer proteinbasierter Vesikel wurden Methoden mit organischen Lösungsmitteln angewendet.8,11,14. Bisher fehlt es bei den angewandten Protokollen für die Vesikelbildung oft an Montagekontrolle über mikrometergroße Baugruppen.16,17oder haben eine begrenzte Montageausbeute5. Darüber hinaus haben einige berichtete ELP-basierte Vesikel ein beeinträchtigtes12oder begrenzte Stabilität im Laufe der Zeit9. Um diese Nachteile zu beheben, ermöglichen die vorgestellten Protokolle die Selbstmontage von mikrometer- und submikrometergroßen supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften, gutem Verkapselungspotenzial und Langzeitstabilität. Maßgeschneiderte amphiphile ELPs fügen sich zu supramolekularen Strukturen zusammen und reichen von kugelförmigen Coacervaten und hochgeordneten verdrehten Faserbündeln bis hin zu unilamelladervetriären Vesikeln, abhängig vom angewandten Protokoll und den damit verbundenen Umgebungsbedingungen. Große vesikuläre ProteinMembran-basierte Fächer (PMBC) zeigen alle Hauptphänotypen wie Membranfusion und Phasentrennungsverhalten analog zu Liposomen. PMBCs kapseln effizient chemisch vielfältige fluoreszierende Ladungsmoleküle, die mit einfacher Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können. Die in dieser Studie verwendeten sich wiederholenden ELP-Domänen sind attraktive Bausteine für proteinbasierte supramolekulare Architekturen18. Die ELP-Pentapeptid-Wiederholungseinheit (VPGVG) ist dafür bekannt, neben Prolin an der vierten Position (Valin, V) unterschiedliche Aa zu tolerieren und dabei ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu erhalten.19. Das Design von amphiphilen ELPs, die ausgeprägte hydrophile und hydrophobe Domänen enthalten, wurde durch einfügen von Aa-Gastrückständen (X) in die VPGXG-Wiederholung mit ausgeprägter Hydrophobie, Polarität und Ladung realisiert.20. Amphiphile ELP-Domänen, die mit hydrophoberphenylalanin (F) oder Isoleucin (I) ausgestattet sind, während die hydrophile Domäne geladene Glutaminsäure (E) oder Arginin (R) als Gästerückstände enthielt. Eine Liste der förderfähigen amphiphilen ELP-Konstrukte und entsprechenden Aa-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Informationen und Referenzen8,21. Alle Bausteine sind entweder mit kleinen Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen zur Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet. mEGFP und andere fluoreszierende Proteine wurden n-terminal mit den hydrophilen Domänen der ELP-Amphiphilen verschmolzen. Organische Farbstoffe wurden über kupferfreie Stämme konjugiert, die Alkyn-Azid-Cycloaddition (SPAAC) zu einer ko-translational eingeführten unnatürlichen Aminosäure (UAA) förderten. Die ko-translationale Einbeziehung der UAApara-Azidophenylalanin (pAzF)22ermöglicht die N-Terminal-Modifikation der hydrophilen ELP-Domäne. Auf diese Weise wird der grüne Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) oder jedes kleine fluoreszierende Molekül mit einem gespannten Zyklopädat kann als Fluoreszenzsonde verwendet werden. Erfolgreiche Einarbeitung des UAA pAzF und Cycloaddition des Farbstoffs über SPAAC kann durch effiziente Ionisierung der entsprechenden tryptischen Peptide einfach über LC-MS/MS bestätigt werden8. Dieser kleine organische Farbstoff wurde angewendet, um die Lösungsmittelauswahl für Montageprotokolle zu erweitern, da fluoreszierende Proteine mit den meisten organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Die beiden effizientesten Montageprotokolle für supramolekulare Strukturen, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden im Folgenden beschrieben. Die THF-Schwellungsmethode ist nur mit organischem Farbstoff modifiziertem amphiphilem ELP kompatibel. Im Gegensatz dazu ist die 1-Butanol-Extrusionsmethode (BuOH) mit vielen Proteinen wie fluoreszierender Sonde, z.B. mEGFP, kompatibel, da die beschriebene Methode die Fluoreszenz dieser Fusionsproteine vollständig bewahrt. Darüber hinaus funktioniert die Verkapselung kleiner Moleküle und das vesikuläre Fusionsverhalten am besten mit der BuOH-Extrusionsmethode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Fehler bei der Befolgung der beschriebenen Protokolle für die Montage definierter supramolekularer Strukturen führt hauptsächlich zur Bildung unspezifischer Aggregate(Abbildung 2, IV) oder zu homogen verteilten ELP-Amphiphilen. Kritische Schritte des Protokolls werden im Folgenden erläutert:
Für eine hohe Expressionsausbeute des amphiphilen ELP ist eine relativ niedrige Temperatur von 20°C optimal. Für eine erfolgreiche Affinitäts-basierte Reinigung de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem BMBF für die finanzielle Unterstützung und dem Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) für die Bereitstellung der Forschungseinrichtung. Wir danken P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornien, USA für die Bereitstellung des Plasmids pEVOL-pAzF. Wir danken den Mitarbeitern des Life Imaging Center (LIC) im Zentrum für Biologische Systemanalyse (ZBSA) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und die hervorragende Unterstützung bei der Bildaufnahme.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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