En Femtoliter dråbe array for massivt parallel proteinsyntese fra single DNA molekyler

Summary

Det overordnede mål med protokollen er at forberede over en million bestilte, ensartet, stabil og biokompatibel femtoliter dråber på en 1 cm² planar substrat, der kan bruges til celle-fri proteinsyntese.

Abstract

Fremskridt inden for geografisk opløsning og detektionsfølsomheden af videnskabelige instrumenter gør det muligt at anvende små reaktorer til biologisk og kemisk forskning. For at imødekomme efterspørgslen efter højtydende mikroreaktorer udviklede vi en femtoliterdråbesystem (FemDA) enhed og eksemplificerede dens anvendelse i massivt parallelle cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner. Over en million ensartede dråber blev let genereret inden for en finger-størrelse område ved hjælp af en to-trins olie-forsegling protokol. Hver dråbe var forankret i en femtoliter mikrokammer bestående af en hydrofil bund og en hydrofob sidevæg. Den hybride hydrofile-i-hydrofobe struktur og de dedikerede tætningsolier og overfladeaktive stoffer er afgørende for stabilt at bevare femtoliter vandig opløsning i femtoliter rummet uden fordampning tab. Femtoliterkonfigurationen og den enkle struktur af FemDA-enheden tillod minimalt reagensforbrug. Den ensartede dimension af dråbereaktorer gjort store kvantitative og tid-kursus målinger overbevisende og pålidelig. FemDA-teknologien korreleret proteinudbyttet af CFPS reaktion med antallet af DNA-molekyler i hver dråbe. Vi strømlinede procedurerne om mikrofabrikation af enheden, dannelsen af femtoliterdråberne og erhvervelsen og analysen af de mikroskopiske billeddata. Den detaljerede protokol med de optimerede lave driftsomkostninger gør FemDA-teknologien tilgængelig for alle, der har standard renrumsfaciliteter og et konventionelt fluorescensmikroskop i deres eget sted.

Introduction

Forskere bruger reaktorer til at udføre bio/kemiske reaktioner. Der er gjort en betydelig indsats for at reducere reaktorens størrelse og øge forsøgskapaciteten for at sænke reagensforbruget og samtidig forbedre arbejdseffektiviteten. Begge aspekter har til formål at befri forskere fra en tung arbejdsbyrde, mindske omkostningerne og fremskynde forskning og udvikling. Vi har en klar historisk køreplan for udviklingen af reaktorteknologierne ud fra reaktionsmængder og gennemløb: enkeltbæger/kolbe/reagensglas, milliliterrør, mikroliterrør, mikroliterstrimler 8-rørstriber, mikroliter 96/384/1536-brøndplade og mikrofluidiske nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer^{1,,2,,3,,4,5,6,7}. Svarende til nedskæringer funktionen størrelse transistorer på integrerede kredsløb chips i halvlederindustrien i de seneste årtier, er bio / kemiske mikroreaktorer går gennem volumenreduktion og systemintegration. Sådanne små værktøjer har haft en dybtgående indvirkning på celle-baseret eller celle-fri syntetisk biologi, biofremstilling, og høj-throughput prototyping og screening^8,9,10,11,12. Dette dokument beskriver vores seneste indsats for at udvikle en unik dråbearray og demonstrerer dens anvendelse i CFPS¹³, en grundlæggende teknologi for syntetiske biologi- og molekylære screeningssamfund¹⁴. Især giver vi bevidst en optimeret og billig protokol for at gøre FemDA-enheden tilgængelig for alle. Den billige og let at håndtere protokol for miniaturiseret enhed ville bidrage til uddannelsesmæssige formål universiteter og bidrage til at sprede teknologien.

FemDA forbereder femtoliterdråber ved en ultrahøj tæthed på 10⁶ pr. 1 cm² på et plant glas substrat. Vi belagt en hydrofob polymer, CYTOP^15,på glasset substrat og selektivt ætset (fjernet) CYTOP på foruddefinerede positioner til at generere en mikrokammer array på substratet. Således er den resulterende mikrokammer består af en hydrofob sidevæg (CYTOP) og en hydrofil bund (glas). Når sekventielt strømmende vand og olie over den mønstrede overflade, kan vandet blive fanget og forseglet i mikrokammer. Den hydrofile-i-hydrofobiske struktur er afgørende for at afvise vand uden for mikrokammeret, isolere individuelle mikroreaktorer og bevare en lille vandig opløsning inde i femtoliterrummet. Den unikke egenskab blev anvendt med succes til fremstilling af vand-i-olie dråber og lipid tolag mikrokommenter^16,17. Sammenlignet med prototypen^{enhed 16,}vi først optimeret mikrofabrikation proces til at realisere en fuldstændig fjernelse af CYTOP polymer samt en fuld eksponering af glasbunden. CYTOP er en speciel fluorpolymer med ekstremt lav overfladespænding (19 mN/m) lavere end for konventionelle mikroreaktormaterialer som glas, plast og silikone. Dens gode optiske, elektriske og kemiske ydeevne er allerede blevet udnyttet i overfladebehandling af mikrofluidic enheder^{18,19,,20,,21,,22,23,24}. I FemDA-systemet skal oliens overfladespænding være lavere end den faste overflade²⁵for at opnå god befugtning af olien på CYTOP-overfladen. Ellers er den flydende olie i kontakt med den faste overflade tendens til at blive sfærisk snarere end at sprede sig over overfladen. Desuden fandt vi, at nogle populære perfluorcarbonolier (f.eks. 3M FC-40)¹⁶ og hydrofluoretherolier (f.eks. 3M Novec-serien) kan opløse CYTOP som følge af CYTOP’s amorfe morfologi, som er fatal for kvantitativ måling og vil være tvivlsom med hensyn til krydskontaminering blandt dråber. Heldigvis identificerede vi en biokompatibel og miljøvenlig olie, der udviser lavere (< 19 mN/m) overfladespænding¹³. Vi fandt også et nyt overfladeaktivt stof, der kan opløses i den valgte olie og funktion i en lav koncentration (0,1%, mindst 10 gange lavere end tidligere rapporteret populære dem^26,,27)¹³. Den resulterende vand / olie interface kan stabiliseres af det overfladeaktive stof. På grund af oliens høje fordampningshastighed, efter skylningen med olien, anvendte vi en anden biokompatibel og miljøvenlig olie til at erstatte den første til at forsegle mikrokammerene. Vi kalder den første olie (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) “flush olie” og den anden olie (Fomblin Y25) den “forsegling olie,” hhv.

Den to-trins olie-forsegling strategi kan realisere en robust dannelse af femtoliter dråbe array inden for få minutter og uden sofistikeret instrumentering. På grund af fordampningsproblemet er det blevet anset for udfordrende at generere mikroreaktorer, der er mindre end picolitervolumener²⁸. FemDA tog fat på dette problem ved systematisk at optimere de materialer og processer, der anvendes til fremstilling af mikroreaktorer/dråber. Flere bemærkelsesværdige træk ved de resulterende dråber omfatter høj ensartethed (eller monodispersity), stabilitet og biokompatibilitet på femtoliter skalaen. Variationskoefficienten (CV) for dråbevolumenet er kun 3% (uden vignettering korrektion for mikroskopiske billeder), det mindste CV blandt dråbeplatforme i verden, hvilket sikrer en meget parallel og kvantitativ måling. Femtoliterdråben er stabil i mindst 24 timer uden krydskontaminering blandt dråber ved stuetemperatur, hvilket er værdifuldt for en pålidelig tidsmåling. Med hensyn til biokompatibilitet lykkedes det os at syntetisere forskellige proteiner fra en enkelt kopi skabelon DNA i femtoliter dråbe, som tidligere var blevet anset for vanskeligt eller^{ineffektivt 29,30}. Det ville være værd at belyse, hvorfor nogle proteiner, der kan syntetiseres i FemDA ikke kan syntetiseres i andre dråbesystemer. FemDA var ikke blot en teknisk fremgang, men indså også en hidtil uset kvantitativ måling, der kan korrelere proteinudbyttet (som afspejlet af dråbens fluorescensintensitet) til antallet af skabelon-DNA-molekyler i hver dråbe. Som følge heraf viste histogrammet for fluorescensintensiteten af dråber fra FemDA-baserede CFPS en diskret fordeling, der kan fint monteres ved en sum gaussisk fordelinger af lige top-til-peak intervaller. Desuden var sandsynligheden for forekomst af dråber, der indeholder forskellige antal DNA-molekyler, en perfekt pasform til en Poisson-fordeling³¹. Således kan de forskellige proteinudbytte i hver dråbe normaliseres baseret på den diskrete fordeling. Denne kritiske funktion giver os mulighed for at adskille enzymatiske aktivitet oplysninger fra den tilsyneladende intensitet, der ikke har været tilgængelig med andre mikroreaktor platforme endnu. Eksisterende mikrofluidiske celle- og dråbesorteringssystemer er dygtige til fuldautomatisk sortering og gode til at koncentrere prøverne , men kan nogle gange kun udsende et relativt bredt eller langthalet histogram i det analytiske aspekt^32,33. Vores meget kvantitative og biokompatible FemDA-system sætter et nyt benchmark og en høj analytisk standard inden for mikroreaktorudvikling.

De olier og overfladeaktive stoffer, der kan anvendes til fremstilling af dråber, er stadig meget begrænsede³⁴. Kombinationen af ASAHIKLIN AE-3000 og SURFLON S-386 etableret i FemDA er et nyt medlem af det voksende arsenal af den fysiokemiske grænseflade mellem den vandige fase og oliefase¹³. Den nye grænseflade i FemDA er fysisk stabil, kemisk inert, og biologisk kompatibel med den komplekse transskription, oversættelse, og post-translationelle modifikation maskiner til mange slags proteiner¹³. Det ville være temmelig attraktivt at finde et protein, der ikke kan syntetiseres i dråbeindstillingerne i stedet. Desuden er omkostningsbesparelserne for reagenser mere tydelig i femtoliterdråbesystemet end i nanolit- og picoliterreaktorsystemer^35,36. Især vil der ofte være en stor død volumen, som hovedsagelig er forårsaget af slanger eller eksterne forsyninger, i mikrofluidic dråbe generation systemer, men ikke i vores FemDA. Array formatet er også begunstiget af gentagne og detaljerede mikroskopiske karakterisering (svarende til såkaldte høj-indhold analyse) for hver enkelt^{reaktor 37}, snarere end kun et enkelt øjebliksbillede for en hurtig bevægelse objekt. Femtoliterskalaen gjorde det muligt at integrere over en million reaktorer på et område i fingerstørrelse, mens det samme antal nanolitreaktorer (hvis det findes) kræver et areal på kvadratmeter, hvilket utvivlsomt ville være upraktisk at fremstille eller anvende et sådant system.

Protocol

1. Mikrofabrikation af femtoliter mikrokammerarrayets substrat BEMÆRK: Udfør følgende mikrofabrikationseksperiment i et renrum. Brug handsker og et renrumsdragt, før du går ind i renrummet. Rengøring dække glas substrat Indstil dækslet glas på et dæksel glas farvning rack. Syr dækglasset i 8 M natriumhydroxid (NaOH) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).FORSIGTIG: NaOH i høje koncentrationer er meget farligt for hud og øjne. Håndter den forsigtigt uden stæn…

Representative Results

Mikrofabrikationsprocessen består af substratrengøring, overfladefunktionalisering, CYTOP-belægning, fotolitografi, tøræt ætsning, fotoresistens stripning og slutrengøring. Det er vigtigt, at den fremlagte protokol tillod fuldstændig fjernelse af den hydrofobe CYTOP polymer inde i mikrokammeret Figur 3A),der producerer en meget parallel hydrofil-i-hydrofob struktur på et standarddækselglas substrat. Ved hjælp af olieforseglingsprotokollen blev den ensartede dimension af de resulte…

Discussion

Den meget kvantitative måling baseret på de meget ensartede, stabile og biokompatible dråber i FemDA gjorde det muligt for diskret distribution, det unikke ved vores undersøgelse adskiller sig fra andre. Vi optimerede og detaljeret mikrofabrikations- og dråbedannelsesprocesserne i dette dokument. Der er flere kritiske trin i den etablerede protokol.

For det første bestemmer den ensartede belægning af meget tyktflydende CYTOP polymer på det rektangulære tynde glassubstrat i høj grad k…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).