単一DNA分子からの超並列タンパク質合成のためのフェムトリットルドロップレットアレイ
Summary
プロトコルの全体的な目標は、無細胞タンパク質合成に使用できる1cm2平面基板上に100万個以上の順序付け、均一、安定した、生体適合性のフェムトリットル液滴を準備することです。
Abstract
科学機器の空間分解能と検出感度の進歩により、小さな原子炉を生物・化学研究に応用することが可能です。高性能マイクロリアクターの需要に応えるため、フェムトリットル滴アレイ(FemDA)装置を開発し、その応用を超並列無細胞タンパク質合成(CFPS)反応に例示しました。2段階のオイルシールプロトコルを使用して、100万個以上の均一な液滴を指サイズの領域内で容易に生成した。すべての液滴は、親水性底部と疎水性側壁から構成されるフェムトリットル微小室に固定した。ハイブリッド親水性疎水性構造と専用のシール油および界面活性剤は、フェムトリットル水溶液を蒸発損失なしでフェムトリットル空間に安定的に保持するために極めて重要です。FemDA装置のフェムトリットル構成および簡単な構造は、最小限の試薬消費を可能にした。液滴反応器の均一な次元は、大規模な定量的および時間経過測定を説得力と信頼性を高くしました。FemDA技術は、CFPS反応のタンパク質収率を各液滴中のDNA分子の数と相関させた。装置の微細加工、フェムトリットル液滴の形成、顕微鏡画像データの取得・解析に関する手順を合理化した。最適化された低ランニングコストの詳細なプロトコルは、FemDA技術を、標準のクリーンルーム施設と従来の蛍光顕微鏡を自分の場所に持っているすべての人が利用できるようにします。
Introduction
研究者は、バイオ/化学反応を行うために原子炉を使用しています。作業効率を向上させながら試薬の消費量を減らすために、反応器のサイズを縮小し、実験スループットを高めるために多大な努力がなされている。どちらの側面も、重い作業負荷から研究者を解放し、コストを削減し、研究開発をスピードアップすることを目指しています。反応量とスループットの観点から原子炉技術の開発に関する明確な歴史的ロードマップを持っています: シングルビーカー/フラスコ/試験管, ミリリットルチューブ, マイクロリットルチューブ, マイクロリットル 8チューブストリップ, マイクロリットル 96/384/1536ウェルプレート, マイクロ流体ナノリットル/ピコリットル/フェムトリットル反応器71,,62,,3,,4,5, 5, 7 ,.過去数十年の半導体産業における集積回路チップ上のトランジスタの特徴サイズを縮小することに似ており、バイオ/化学マイクロリアクターは体積削減とシステム統合を経ています。このような小規模なツールは、細胞ベースまたは無細胞合成生物学、バイオマニュファクチャリング、およびハイスループットプロトタイピングとスクリーニング898、9、10、11、1210,11に大きな影響を12与えました。,この論文は、ユニークな液滴アレイ技術の開発に関する我々の最近の取り組みについて述べ、合成生物学および分子スクリーニングコミュニティ14の基礎技術であるCFPS13におけるその応用を実証する。特に、FemDAデバイスを誰もがアクセスできるように、最適化された低コストのプロトコルを意図的に提供しています。小型化された装置のための低コストで扱いやすいプロトコルは、大学の教育目的に貢献し、技術を広めるのに役立ちます。
FemDAは平面ガラス基板上の1cm2あたり106の超高密度でフェムトリットルの液滴を準備する。我々は、疎水性ポリマーCYTOP15をガラス基板上にコーティングし、あらかじめ定義された位置でCYTOPを選択的にエッチング(除去)し、基板上にマイクロチャンバアレイを生成した。これにより、得られたマイクロチャンバは、疎水性側壁(CYTOP)と親水性底部(ガラス)から構成される。パターン化された表面上に水と油を順次流させると、水を閉じ込めてマイクロチャンバーに密封することができます。親水性疎水性構造は、マイクロチャンバーの外の水を撃退し、個々のマイクロリアクターを単離し、フェムトリットル空間内の小さな水溶液を保持するために不可欠です。このユニークな性質は、油中水滴および脂質二重層マイクロコンパートメント16,17,17の調製にうまく適用された。試作装置16と比較して、まず、CYTOPポリマーの完全な除去とガラス底の完全な露出を実現するために、微細加工プロセスを最適化した。CYTOPはガラス、プラスチック、シリコーンなどの従来のマイクロリアクター材料よりも極端に低い表面張力(19 mN/m)を特色にする特殊なフルオロポリマーである。その良好な光学、電気、および化学的性能は、マイクロ,流体デバイス,18、19、20、21、22、23、24の表面処理にすでに利用されている。18,19,2021,2223,24FemDAシステムにおいて、CYTOP表面上の油の濡れ良好を達成するためには、油の表面張力は固体表面25のそれよりも低くなければならない。それ以外の場合、固体表面に接触する液体油は、表面上に広がるのではなく球状になる傾向があります。また、一般的なパーフルオロカーボンオイル(例えば、3M FC-40)16およびハイドロフル16オロエーテル油(例えば、3M Novecシリーズ)は、定量的測定に致命的であり、滴滴間の交差汚染の面で疑わしいCYTOPを溶解できることを発見した。幸いにも、我々は、低い(< 19 mN /m)表面張力を示す生体適合性および環境に優しい油を同定した。また、選択した油と機能に低濃度で溶解できる新しい界面活性剤(0.1%、以前に報告された人気のもの26、27),27よりも少なくとも10倍低い13を発見した。得られた水/油界面は界面活性剤によって安定させることができる。油の蒸発率が高いため、油とのフラッシュに続いて、マイクロチャンバーを密封する最初のものを交換するために別の生体適合性と環境に優しい油を塗布しました。第1油(アサヒクリンAE-3000 0.1重量%SURFLON S-386)を「フラッシュオイル」と呼び、第2のオイル(Fomblin Y25)をそれぞれ「シーリングオイル」と呼んでいます。
2段階のオイルシール戦略は、数分以内に、洗練された計装なしでフェムトリットルの液滴アレイの堅牢な形成を実現することができます。蒸発問題のため、ピコリットル体積28より小さいマイクロリアクターを生成することは困難と考えられている。FemDAは、マイクロリアクター/液滴の調製に使用される材料とプロセスを体系的に最適化することによって、この問題に取り組んだ。得られた液滴のいくつかの注目すべき特徴は、高い均一性(または単分散性)、安定性、およびフェムトリットルスケールでの生体適合性を含む。液滴体積の変動係数(CV)はわずか3%(顕微鏡画像の補正なし)で、世界で最も小さいCVであり、高度に平行かつ定量的な測定が保証されます。フェムトリットルの液滴は、室温で液滴間の交差汚染なしに少なくとも24時間安定しており、信頼性の高い時間経過測定に役立ちます。生体適合性に関しては、これまで困難または非効率的な29,30,30と考えられていたフェムトリットル液滴中の単一コピー鋳型DNAから様々なタンパク質を合成することに成功しました。FemDAで合成できるタンパク質が他の液滴系で合成できない理由を解明する価値があります。FemDAは単なる技術的進歩ではなく、タンパク質収率(液滴の蛍光強度に反映される)を各液滴中の鋳型DNA分子の数に相関させる、これまでにない定量的測定を実現しました。その結果、FemDAベースCFPSからの液滴の蛍光強度のヒストグラムは、等しいピークからピーク間隔のガウス分布の合計によってうまく適合することができる離散分布を示した。また、異なる数のDNA分子を含む液滴の発生確率は、ポアソン分布31に完全に適合した。これにより、各液滴における異なるタンパク質収率を、離散分布に基づいて正規化することができる。この重要な機能により、他のマイクロリアクタープラットフォームでは利用できない、見かけの強度から酵素活性情報を分離することができます。既存のマイクロ流体細胞/液滴選別システムは、全自動選別に熟練しており、サンプルを濃縮するのが得意であるが、分析的側面32、33,33において比較的広いまたは長い尾のヒストグラムしか出力できない場合もある。当社の高い定量性と生体適合性のFemDAシステムは、マイクロリアクター開発の分野で新しいベンチマークと高い分析基準を設定します。
液滴の調製に使用できる油および界面活性剤は依然として非常に限られた34である。FemDAに設立されたアサヒクリンAE-3000とSURFLON S-386の組み合わせは、水相と油相13との間の物理化学的界面の成長兵器の新しいメンバーである。FemDAの新しい界面は、物理的に安定しており、化学的に不活性であり、そして多種類のタンパク質13に対する複雑な転写、翻訳、および翻訳後修飾機械と生物学的に適合する。代わりに液滴の設定で合成できないタンパク質を見つけることはかなり魅力的であろう.また、試薬のコスト削減は、ナノリットルおよびピコリットル反応器システム35,36,のそれよりもフェムトリットル滴系においてより明らかである。特に、微小液滴発生システムではチューブや外部供給によって主に引き起こされる大きなデッドボリュームが、私たちのFemDAには存在しないことがよくあります。配列フォーマットは、動きの速い物体の単一のスナップショットだけでなく、すべての単一のリアクタ37に対して繰り返し、詳細な微視的特徴付け(いわゆる高コンテンツ分析に類似)によっても好まれる。フェムトリットルスケールは、指サイズの領域に100万基以上の原子炉を統合することを可能にしましたが、同じ数のナノリットル原子炉(存在する場合)は平方メートル面積を超える必要があり、そのようなシステムを製造または使用することは間違いなく実用的ではありません。
Protocol
Representative Results
Discussion
FemDAの高い均一で安定した生体適合性の液滴に基づく定量的な測定は、離散分布を可能にし、我々の研究のユニークな特徴は他のものとは異なる。本論文では、微細加工と液滴形成プロセスを体系的に最適化し、詳細に説明した。確立されたプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。
まず、矩形薄ガラス基板上に高粘性CYTOPポリマーの均一なコーティングが得?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、JSPSKAKENHI助成番号JP18K14260と海洋研究開発機構の予算によって支援されました。作者化設備を提供してくださった出口茂(JAMSTEC)と久田哲郎(JAMSTEC)に感謝します。高井健(JAMSTEC)の商用ソフトウェアサポートに感謝します。東京大学武田戦館スーパークリーンルームにて、文部科学省(MEXT)の「ナノテクノロジープラットフォームプログラム」に支えられ、グラント番号JPMXP09F19UT0087を実施しました。
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
References
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