Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Summary

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm² que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Abstract

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

Introduction

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores^{1,,2,3,,4,5,6,7}. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade^{8,,9,,10,,11,12}. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS¹³, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular¹⁴. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.

FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 10⁶ por 1 cm² em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP^15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas^16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo^16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos^{18,19,20,,21,,22,,23,,24}. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida²⁵. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)¹⁶ e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)¹³. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente^26,27)¹³. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o “óleo de descarga” e o segundo óleo (Fomblin Y25) o “óleo de vedação”, respectivamente.

A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter²⁸. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente^29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson³¹. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico^32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.

Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados³⁴. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase¹³do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas¹³. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter^35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator³⁷, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

Protocol

1. Microfabricação do substrato de matriz de microcrobra femtoliter NOTA: Realize o seguinte experimento de microfabização em uma sala de limpeza. Use luvas e um terno de limpeza antes de entrar na sala de limpeza. Substrato de vidro de cobertura de limpeza Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT).ATENÇÃO: O NaOH em altas concent…

Representative Results

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação…

Discussion

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.

Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retang…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).