Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Summary

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm² qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Abstract

Les progrès réalisés dans la résolution spatiale et la sensibilité à la détection de l’instrumentation scientifique permettent d’appliquer de petits réacteurs pour la recherche biologique et chimique. Pour répondre à la demande de microréacteurs haute performance, nous avons mis au point un dispositif femtoliter droplet array (FemDA) et illustré son application dans des réactions massivement parallèles de synthèse de protéines sans cellules (CFPS). Plus d’un million de gouttelettes uniformes ont été facilement générées dans une zone de la taille d’un doigt à l’aide d’un protocole d’étanchéité à l’huile en deux étapes. Chaque gouttelette était ancrée dans une microchamber femtoliter composée d’un fond hydrophile et d’un paroi latérale hydrophobe. La structure hydrophile-in-hydrophobe hybride et les huiles d’étanchéité et les surfactants dédiés sont essentiels pour conserver de façon stable la solution aqueuse femtoliter dans l’espace femtoliter sans perte d’évaporation. La configuration femtoliter et la structure simple du dispositif FemDA ont permis une consommation minimale de réactifs. La dimension uniforme des réacteurs à gouttelettes a rendu les mesures quantitatives et temporelles à grande échelle convaincantes et fiables. La technologie FemDA a corrélé le rendement protéique de la réaction du SCFP avec le nombre de molécules d’ADN dans chaque gouttelette. Nous avons rationalisé les procédures concernant la microfabrication de l’appareil, la formation des gouttelettes de femtoliter, et l’acquisition et l’analyse des données d’image microscopiques. Le protocole détaillé avec le faible coût de fonctionnement optimisé rend la technologie FemDA accessible à tous ceux qui ont des installations de nettoyage standard et un microscope à fluorescence classique à leur place.

Introduction

Les chercheurs utilisent des réacteurs pour effectuer des réactions bio/chimiques. Des efforts importants ont été déployés pour réduire la taille du réacteur et augmenter le débit expérimental afin de réduire la consommation de réactifs tout en améliorant l’efficacité du travail. Ces deux aspects visent à libérer les chercheurs d’une lourde charge de travail, en réduisant les coûts et en accélérant la recherche et le développement. Nous disposons d’une feuille de route historique claire sur le développement des technologies des réacteurs du point de vue des volumes de réaction et du débit : béchers/flacons/tubes à essai simples, tubes millilitres, tubes microlitres, microlitres 8 tubes, microlitres 96/384/1536-puits, et nanolitre microfluidique/picoliter/femtoliter réacteurs^{1,2,3,4,5,6,7}. Analogue à la réduction de la taille des caractéristiques des transistors sur les puces de circuits intégrés dans l’industrie des semi-conducteurs au cours des dernières décennies, les microréacteurs bio/chimiques sont en cours de réduction du volume et d’intégration du système. Ces outils à petite échelle ont eu un impact profond sur la biologie synthétique à base de cellules ou sans cellules, la biomaufacturing, et le prototypage et le dépistage à haut débit^8,9,10,11,12. Cet article décrit nos efforts récents sur le développement d’une technologie unique de tableau de gouttelettes et démontre son application dans CFPS¹³, une technologie fondamentale pour la biologie synthétique et les communautés de dépistage moléculaire¹⁴. En particulier, nous fournissons intentionnellement un protocole optimisé et peu coûteux pour rendre le dispositif FemDA accessible à tous. Le protocole à faible coût et facile à manipuler pour l’appareil miniaturisé contribuerait aux objectifs éducatifs des universités et aiderait à diffuser la technologie.

FemDA prépare des gouttelettes de femtoliter à une densité ultra-élevée de 10⁶ par 1 cm² sur un substrat en verre planaire. Nous avons enduit un polymère hydrophobe, CYTOP¹⁵, sur le substrat de verre et gravé sélectivement (enlevé) CYTOP à des positions prédéfinies pour générer un tableau de microchambre sur le substrat. Ainsi, la microchambre qui en résulte est composée d’une paroi hydrophobe (CYTOP) et d’un fond hydrophile (verre). Lorsque l’eau et l’huile coulent séquentiellement sur la surface à motifs, l’eau peut être emprisonnée et scellée dans les microchambres. La structure hydrophile-in-hydrophobe est essentielle pour repousser l’eau à l’extérieur des microchambres, isoler les microréacteurs individuels et conserver une minuscule solution aqueuse à l’intérieur de l’espace femtoliter. La propriété unique a été appliquée avec succès pour la préparation de gouttelettes d’eau dans l’huile et de microcompartements bicalaires lipidiques^16,17. Par rapport au prototype¹⁶, nous avons d’abord optimisé le processus de microfabrication pour réaliser une élimination complète du polymère CYTOP ainsi qu’une exposition complète du fond de verre. CYTOP est un fluoropolymère spécial dont la tension de surface est extrêmement faible (19 mN/m) inférieure à celle des matériaux microréacteurs conventionnels tels que le verre, les plastiques et le silicone. Ses bonnes performances optiques, électriques et chimiques ont déjà été utilisées dans le traitement de surface des dispositifs microfluidiques^{18,19,20,21,22,23,24}. Dans le système FemDA, pour obtenir un bon mouillage de l’huile sur la surface du CYTOP, la tension de surface de l’huile doit être inférieure à celle de la surface solide²⁵. Sinon, l’huile liquide en contact avec la surface solide tend à devenir sphérique plutôt que de se répandre sur la surface. En outre, nous avons constaté que certaines huiles populaires de perfluorocarbone (par exemple, 3M FC-40)¹⁶ et les huiles hydrofluoroéther (par exemple, 3M série Novec) peuvent dissoudre CYTOP à la suite de la morphologie amorphe de CYTOP, qui est fatale à la mesure quantitative et serait discutable en termes de contamination croisée entre les gouttelettes. Heureusement, nous avons identifié une huile biocompatible et respectueuse de l’environnement présentant une tension de surface inférieure (< 19 mN/m)¹³. Nous avons également trouvé un nouveau surfactant qui peut se dissoudre dans l’huile sélectionnée et fonctionner dans une faible concentration (0,1%, au moins 10 fois plus faible que précédemment rapporté populaires^26,27)¹³. L’interface eau/huile qui en résulte peut être stabilisée par le surfactant. En raison du taux d’évaporation élevé de l’huile, après la chasse d’eau avec l’huile, nous avons appliqué une autre huile biocompatible et respectueuse de l’environnement pour remplacer la première pour sceller les microchambres. Nous appelons la première huile (ASASHIKLIN AE-3000 avec 0,1 wt % SURFLON S-386) l’huile de chasse d’eau et la deuxième huile (Fomblin Y25) l’huile d’étanchéité, respectivement.

La stratégie d’étanchéité à l’huile en deux étapes peut réaliser une formation robuste du tableau de gouttelettes femtoliter en quelques minutes et sans instrumentation sophistiquée. En raison du problème d’évaporation, il a été considéré comme difficile de générer des microréacteurs plus petits que les volumes de picolteur²⁸. FemDA a abordé ce problème en optimisant systématiquement les matériaux et les procédés utilisés pour la préparation des microréacteurs/gouttelettes. Plusieurs caractéristiques notables des gouttelettes résultantes incluent l’uniformité élevée (ou monodispersité), la stabilité, et la biocompatibilité à l’échelle femtoliter. Le coefficient de variation (CV) du volume des gouttelettes n’est que de 3% (sans correction de vignette pour les images microscopiques), le plus petit CV parmi les plates-formes de gouttelettes dans le monde, ce qui assure une mesure très parallèle et quantitative. La gouttelette de femtoliter est stable pendant au moins 24 heures sans contamination croisée entre les gouttelettes à température ambiante, ce qui est précieux pour une mesure fiable du cours du temps. En ce qui concerne la biocompatibilité, nous avons réussi à synthétiser diverses protéines à partir d’un modèle d’ADN à copie unique dans la gouttelette femtoliter, qui avait été précédemment considéré comme difficile ou inefficace^29,30. Il serait digne d’élucider pourquoi certaines protéines capables d’être synthétisées dans le FemDA ne peuvent pas être synthétisées dans d’autres systèmes de gouttelettes. FemDA n’était pas seulement un progrès technique, mais a également réalisé une mesure quantitative sans précédent qui peut corréler le rendement des protéines (tel que reflété par l’intensité de fluorescence de la gouttelette) au nombre de molécules d’ADN de modèle dans chaque gouttelette. En conséquence, l’histogramme de l’intensité de fluorescence des gouttelettes du CFPS à base de FemDA a montré une distribution discrète qui peut être bien ajustée par une somme de distributions gaussiennes d’intervalles de pointe à pic égaux. En outre, la probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres de molécules d’ADN était un ajustement parfait à une distribution poisson³¹. Ainsi, le rendement protéique différent dans chaque gouttelette peut être normalisé en fonction de la distribution discrète. Cette caractéristique critique nous permet de séparer l’information d’activité enzymatique de l’intensité apparente, qui n’a pas encore été disponible avec d’autres plates-formes de microréacteurs. Les systèmes de tri des cellules/gouttelettes microfluidiques existants sont habiles dans le tri entièrement automatique et bons pour concentrer des échantillons, mais parfois ne peuvent produire qu’un histogramme relativement large ou à longue queue dans l’aspect analytique^32,33. Notre système FemDA hautement quantitatif et biocompatible établit une nouvelle référence et une norme analytique élevée dans le domaine du développement des microréacteurs.

Les huiles et les surfactants qui pourraient être utilisés pour la préparation des gouttelettes sont encore très limitées³⁴. La combinaison d’ASASHIKLIN AE-3000 et DE SURFLON S-386 établie à FemDA est un nouveau membre de l’arsenal croissant de l’interface physiochimique entre la phase aqueuse et la phase¹³de l’huile. La nouvelle interface de FemDA est physiquement stable, chimiquement inerte et biologiquement compatible avec les machines complexes de transcription, de traduction et de modification post-translationnelle pour de nombreuses sortes de protéines¹³. Il serait plutôt intéressant de trouver une protéine qui ne peut pas être synthétisée dans les paramètres de gouttelettes à la place. En outre, l’économie de coûts des réactifs est plus évidente dans le système de gouttelettes femtoliter que celle dans les systèmes de réacteurs nanolitres et picoliter^35,36. En particulier, il y aurait souvent un grand volume mort, qui est principalement causé par des tubes ou des fournitures externes, dans les systèmes de génération de gouttelettes microfluidiques, mais pas dans notre FemDA. Le format de tableau est également favorisé par une caractérisation microscopique répétée et détaillée (similaire à ce qu’on appelle l’analyse à haute teneur) pour chaque réacteur³⁷, plutôt que par un seul instantané pour un objet en mouvement rapide. L’échelle femtoliter a permis l’intégration de plus d’un million de réacteurs sur une zone de la taille d’un doigt, alors que le même nombre de réacteurs nanolitres (s’il existe) nécessite une superficie de plus de mètres carrés, ce qui ne serait sans aucun doute pas pratique pour fabriquer ou utiliser un tel système.

Protocol

1. Microfabrication du substrat de microchambre femtoliter REMARQUE : Effectuez l’expérience de microfabrication suivante dans une salle propre. Portez des gants et un costume de chambre blanche avant d’entrer dans la salle blanche. Substrat de verre de couverture de nettoyage Placez le verre de couverture sur une grille de coloration en verre de couverture. Soniré le verre de couverture en hydroxyde de sodium de 8 M (NaOH) pendant 15 min à température ambiante (RT).<…

Representative Results

Le processus de microfabrication consiste en le nettoyage du substrat, la fonctionnalisation de surface, le revêtement CYTOP, la photolithographie, la gravure sèche, le décapage photorésiste et le nettoyage final. Fait important, le protocole présenté a permis l’enlèvement complet du polymère cytop hydrophobe à l’intérieur des microchambres Figure 3A),produisant une structure hydrophile-in-hydrophobe très parallèle sur un substrat en verre de couverture standard. À l’aide …

Discussion

La mesure hautement quantitative basée sur les gouttelettes hautement uniformes, stables et biocompatibles de FemDA a permis la distribution discrète, la caractéristique unique de notre étude différant des autres. Nous avons systématiquement optimisé et détaillé les processus de microfabrication et de formation de gouttelettes dans cet article. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole établi.

Tout d’abord, le revêtement uniforme du polymère CYTOP très visqueux sur le…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).