Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen
Summary
Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, über eine Million geordnete, einheitliche, stabile und biokompatible Femtolitertröpfchen auf einem 1 cm2 planaren Substrat herzustellen, das für die zellfreie Proteinsynthese verwendet werden kann.
Abstract
Fortschritte bei der räumlichen Auflösung und Detektionsempfindlichkeit wissenschaftlicher Instrumente ermöglichen die Anwendung kleiner Reaktoren für die biologische und chemische Forschung. Um der Nachfrage nach Hochleistungs-Mikroreaktoren gerecht zu werden, haben wir ein Femtoliter-Tröpfchen-Array (FemDA)-Gerät entwickelt und seine Anwendung in massiv parallelen zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) veranschaulicht. Über eine Million gleichmäßige Tröpfchen wurden mit einem zweistufigen Ölabdichtungsprotokoll problemlos in einem fingergroßen Bereich erzeugt. Jedes Tröpfchen wurde in einer Femtoliter-Mikrokammer verankert, die aus einem hydrophilen Boden und einer hydrophoben Seitenwand besteht. Die hybride hydrophil-in-hydrophobe Struktur und die speziellen Dichtöle und Tenside sind entscheidend, um die femtoliter wässrige Lösung im Femtoliter-Raum ohne Verdunstungsverlust stabil zu halten. Die Femtoliter-Konfiguration und die einfache Struktur des FemDA-Geräts ermöglichten einen minimalen Reagenzverbrauch. Die einheitliche Dimension der Tröpfchenreaktoren machte großflächige quantitative und Zeitverlaufsmessungen überzeugend und zuverlässig. Die FemDA-Technologie korrelierte den Proteinertrag der CFPS-Reaktion mit der Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen. Wir rationalisierten die Verfahren über die Mikrofertigung des Geräts, die Bildung der Femtolitertröpfchen und die Erfassung und Analyse der mikroskopischen Bilddaten. Das detaillierte Protokoll mit den optimiertniedrigen Betriebskosten macht die FemDA-Technologie für jeden zugänglich, der über Standard-Reinraumeinrichtungen und ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop an seinem eigenen Platz verfügt.
Introduction
Die Forscher verwenden Reaktoren, um biochemische Reaktionen durchzuführen. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Größe des Reaktors zu verringern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, um den Reagenzienverbrauch zu senken und gleichzeitig die Arbeitseffizienz zu verbessern. Beide Aspekte zielen darauf ab, Forscher von einer hohen Arbeitsbelastung zu befreien, die Kosten zu senken und Forschung und Entwicklung zu beschleunigen. Wir haben eine klare historische Roadmap über die Entwicklung der Reaktortechnologien aus der Sicht der Reaktionsvolumina und des Durchsatzes: Einzelbecher/Kolben/Teströhren, Milliliter-Röhren, Mikroliter-Röhren, Mikroliter 8-Röhren-Streifen, Mikroliter 96/384/1536-Well-Platte und mikrofluidische Nanoliter/Picoliter/Femtoliter-Reaktoren1,2,3,4,5,6,,7. Analog zur Verkleinerung der Funktionsgröße von Transistoren auf integrierten Schaltungschips in der Halbleiterindustrie in den letzten Jahrzehnten durchlaufen bio-chemische Mikroreaktoren Volumenreduktion und Systemintegration. Solche kleinen Werkzeuge haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die zellbasierte oder zellfreie synthetische Biologie, Biomanufacturing und High-Throughput-Prototyping und Screening8,9,10,11,12. Dieses Papier beschreibt unsere jüngsten Bemühungen um die Entwicklung einer einzigartigen Tröpfchen-Array-Technologie und demonstriert ihre Anwendung in CFPS13, einer grundlegenden Technologie für synthetische Biologie und molekulare Screening-Gemeinschaften14. Insbesondere stellen wir bewusst ein optimiertes und kostengünstiges Protokoll bereit, um das FemDA-Gerät für jedermann zugänglich zu machen. Das kostengünstige und einfach zu handhabende Protokoll für das miniaturisierte Gerät würde zu den Bildungszwecken der Universitäten beitragen und zur Verbreitung der Technologie beitragen.
FemDA bereitet Femtolitertröpfchen mit einer ultrahohen Dichte von 106 pro 1 cm2 auf einem planaren Glassubstrat vor. Wir beschichteten ein hydrophobes Polymer, CYTOP15, auf dem Glassubstrat und selektiv geätzt (entfernt) CYTOP an vordefinierten Positionen, um ein Mikrokammer-Array auf dem Substrat zu erzeugen. So besteht die resultierende Mikrokammer aus einer hydrophoben Seitenwand (CYTOP) und einem hydrophilen Boden (Glas). Wenn wasser und öl nacheinander über die gemusterte Oberfläche fließen, kann das Wasser eingefangen und in die Mikrokammern versiegelt werden. Die hydrophil-in-hydrophobe Struktur ist entscheidend für die Abstoßung von Wasser außerhalb der Mikrokammern, die Isolierung einzelner Mikroreaktoren und die Beibehaltung einer winzigen wässrigen Lösung im Femtoliterraum. Die einzigartige Eigenschaft wurde erfolgreich für die Herstellung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen und Lipid-Doppelschicht-Mikrokompartimenten16,17angewendet. Im Vergleich zum Prototypgerät16haben wir zunächst den Mikrofertigungsprozess optimiert, um eine vollständige Entfernung des CYTOP-Polymers sowie eine vollständige Belichtung des Glasbodens zu realisieren. CYTOP ist ein spezielles Fluorpolymer mit extrem niedriger Oberflächenspannung (19 mN/m) niedriger als herkömmliche Mikroreaktormaterialien wie Glas, Kunststoffe und Silikon. Seine gute optische, elektrische und chemische Leistung wurden bereits in der Oberflächenbehandlung von mikrofluidischen Geräten18,19,20,21,22,23,24eingesetzt. Im FemDA-System muss die Oberflächenspannung des Öls niedriger sein als die der festen Oberfläche25. Andernfalls neigt das flüssige Öl, das mit der festen Oberfläche in Berührung kommt, dazu, kugelförmig zu werden, anstatt sich über die Oberfläche auszubreiten. Außerdem fanden wir heraus, dass einige beliebte Perfluorkohlenstofföle (z. B. 3M FC-40)16 und Fluorentöle (z. B. 3M Novec-Serie) CYTOP als Folge der amorphen Morphologie von CYTOP auflösen können, was für die quantitative Messung tödlich ist und in Bezug auf die Kreuzkontamination unter Tröpfchen fragwürdig wäre. Glücklicherweise haben wir ein biokompatibles und umweltfreundliches Öl mit niedrigerer (< 19 mN/m) Oberflächenspannung13identifiziert. Wir fanden auch ein neues Tensid, das sich im ausgewählten Öl auflösen und in geringer Konzentration (0,1%, mindestens 10-mal niedriger als zuvor berichtetbeliebte 26,27)13funktionieren kann. Die resultierende Wasser-Öl-Schnittstelle kann durch das Tensid stabilisiert werden. Aufgrund der hohen Verdunstungsrate des Öls, nach dem Spülen mit dem Öl, haben wir ein weiteres biokompatibles und umweltfreundliches Öl eingesetzt, um das erste zu ersetzen, das die Mikrokammern versiegelt. Wir nennen das erste Öl (ASAHIKLIN AE-3000 mit 0,1 Gew.-SURFLON S-386) das “Flush Oil” und das zweite Öl (Fomblin Y25) das “Dichtungsöl”.
Die zweistufige Ölabdichtungsstrategie kann innerhalb von Minuten und ohne ausgeklügelte Instrumentierung eine robuste Formation des Femtoliter-Tröpfchen-Arrays realisieren. Aufgrund des Verdampfungsproblems wurde es als schwierig angesehen, Mikroreaktoren zu erzeugen, die kleiner als Pikolitervolumen28sind. FemDA befasste sich mit diesem Problem, indem sie die Materialien und Verfahren zur Herstellung von Mikroreaktoren/Tröpfchen systematisch optimierte. Einige bemerkenswerte Merkmale der resultierenden Tröpfchen sind die hohe Gleichmäßigkeit (oder Monodispersität), Stabilität und Biokompatibilität auf der Femtoliter-Skala. Der Variationskoeffizient (CV) des Tröpfchenvolumens beträgt nur 3% (ohne Vignettierungskorrektur für die mikroskopischen Bilder), der kleinste CV unter den Tröpfchenplattformen der Welt, der eine hochparallele und quantitative Messung gewährleistet. Das Femtolitertröpfchen ist mindestens 24 Stunden stabil ohne Kreuzkontamination unter Tröpfchen bei Raumtemperatur, was für eine zuverlässige Zeitverlaufsmessung wertvoll ist. In Bezug auf die Biokompatibilität ist es uns gelungen, verschiedene Proteine aus einer Einzelkopie-Vorlagen-DNA im Femtoliter-Tröpfchen zu synthetisieren, die zuvor als schwierig oder ineffizient galt29,30. Es wäre wert, aufzuklären, warum einige Proteine, die in der FemDA synthetisiert werden können, nicht in anderen Tröpfchensystemen synthetisiert werden können. FemDA war nicht nur eine technische Weiterentwicklung, sondern realisierte auch eine beispiellose quantitative Messung, die den Proteinertrag (wie durch die Fluoreszenzintensität des Tröpfchens reflektiert) mit der Anzahl der Vorlagen-DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen korrelieren kann. Infolgedessen zeigte das Histogramm der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen aus FemDA-basiertem CFPS eine diskrete Verteilung, die durch eine Summe von Gaußschen Verteilungen gleicher Peak-to-Peak-Intervalle gut angepasst werden kann. Darüber hinaus passte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Dna-Moleküle enthielten, perfekt zu einer Poisson-Verteilung31. So kann der unterschiedliche Proteinertrag in jedem Tröpfchen auf der Grundlage der diskreten Verteilung normalisiert werden. Diese kritische Funktion ermöglicht es uns, die enzymatischen Aktivitätsinformationen von der scheinbaren Intensität zu trennen, die bei anderen Mikroreaktorplattformen noch nicht verfügbar war. Bestehende mikrofluidische Zell-/Tröpfchensortiersysteme sind in der vollautomatischen Sortierung und gut in der Konzentration von Proben ausgebildet, können aber manchmal nur ein relativ breites oder langschwanzes Histogramm im analytischen Aspekt32,33ausgeben. Unser hochquantitatives und biokompatibles FemDA-System setzt neue Maßstäbe und einen hohen analytischen Standard im Bereich der Mikroreaktorentwicklung.
Die Öle und Tenside, die zur Herstellung von Tröpfchen verwendet werden könnten, sind noch sehr begrenzt34. Die Kombination von ASAHIKLIN AE-3000 und SURFLON S-386 mit Sitz in FemDA ist ein neues Mitglied des wachsenden Arsenals der physiochemischen Schnittstelle zwischen wässriger Phase und Ölphase13. Die neue Schnittstelle in FemDA ist physikalisch stabil, chemisch inert und biologisch kompatibel mit der komplexen Transkriptions-, Übersetzungs- und posttranslationalen Modifikationsmaschinerie für viele Arten von Proteinen13. Es wäre ziemlich attraktiv, ein Protein zu finden, das nicht stattdessen in den Tröpfcheneinstellungen synthetisiert werden kann. Außerdem ist die Kostenersparnis von Reagenzien im Femtoliter-Tröpfchensystem deutlicher als bei Nanoliter- und Picoliter-Reaktorsystemen35,36. Insbesondere würde es oft ein großes Totvolumen geben, das hauptsächlich durch Schläuche oder externe Vorräte in mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungssystemen verursacht wird, aber nicht in unserer FemDA. Das Array-Format wird auch durch wiederholte und detaillierte mikroskopische Charakterisierung (ähnlich der sogenannten High-Content-Analyse) für jeden einzelnen Reaktor37begünstigt, anstatt nur durch einen einzigen Schnappschuss für ein schnell bewegliches Objekt. Die Femtoliter-Skala ermöglichte die Integration von über einer Million Reaktoren auf einer fingergroßen Fläche, während die gleiche Anzahl von Nanoliter-Reaktoren (falls vorhanden) eine Fläche von über einer Quadratmeterfläche erfordert, was zweifellos unpraktisch wäre, um ein solches System herzustellen oder zu nutzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hochquantitative Messung auf Basis der hochgleichmäßigen, stabilen und biokompatiblen Tröpfchen in FemDA ermöglichte die diskrete Verteilung, das einzigartige Merkmal unserer Studie unterscheidet sich von anderen. In diesem Papier haben wir die Mikroherstellungs- und Tröpfchenbildungsprozesse systematisch optimiert und detailliert beschrieben. Es gibt mehrere kritische Schritte im etablierten Protokoll.
Zunächst bestimmt die gleichmäßige Beschichtung des hochviskosen CYTOP-Polymers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nummer JP18K14260 und dem Budget der Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology unterstützt. Wir danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) und Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) für die Bereitstellung der Charakterisierungsmöglichkeiten. Wir danken Ken Takai (JAMSTEC) für die kommerzielle Software-Unterstützung. Die Mikrofabrikation wurde in Takeda Sentanchi Supercleanroom, Der Universität Tokio, durchgeführt, unterstützt vom “Nanotechnology Platform Program” des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
References
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
