Det overordnede mål med protokollen er at forberede over en million bestilte, ensartet, stabil og biokompatibel femtoliter dråber på en 1 cm2 planar substrat, der kan bruges til celle-fri proteinsyntese.
Fremskridt inden for geografisk opløsning og detektionsfølsomheden af videnskabelige instrumenter gør det muligt at anvende små reaktorer til biologisk og kemisk forskning. For at imødekomme efterspørgslen efter højtydende mikroreaktorer udviklede vi en femtoliterdråbesystem (FemDA) enhed og eksemplificerede dens anvendelse i massivt parallelle cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner. Over en million ensartede dråber blev let genereret inden for en finger-størrelse område ved hjælp af en to-trins olie-forsegling protokol. Hver dråbe var forankret i en femtoliter mikrokammer bestående af en hydrofil bund og en hydrofob sidevæg. Den hybride hydrofile-i-hydrofobe struktur og de dedikerede tætningsolier og overfladeaktive stoffer er afgørende for stabilt at bevare femtoliter vandig opløsning i femtoliter rummet uden fordampning tab. Femtoliterkonfigurationen og den enkle struktur af FemDA-enheden tillod minimalt reagensforbrug. Den ensartede dimension af dråbereaktorer gjort store kvantitative og tid-kursus målinger overbevisende og pålidelig. FemDA-teknologien korreleret proteinudbyttet af CFPS reaktion med antallet af DNA-molekyler i hver dråbe. Vi strømlinede procedurerne om mikrofabrikation af enheden, dannelsen af femtoliterdråberne og erhvervelsen og analysen af de mikroskopiske billeddata. Den detaljerede protokol med de optimerede lave driftsomkostninger gør FemDA-teknologien tilgængelig for alle, der har standard renrumsfaciliteter og et konventionelt fluorescensmikroskop i deres eget sted.
Forskere bruger reaktorer til at udføre bio/kemiske reaktioner. Der er gjort en betydelig indsats for at reducere reaktorens størrelse og øge forsøgskapaciteten for at sænke reagensforbruget og samtidig forbedre arbejdseffektiviteten. Begge aspekter har til formål at befri forskere fra en tung arbejdsbyrde, mindske omkostningerne og fremskynde forskning og udvikling. Vi har en klar historisk køreplan for udviklingen af reaktorteknologierne ud fra reaktionsmængder og gennemløb: enkeltbæger/kolbe/reagensglas, milliliterrør, mikroliterrør, mikroliterstrimler 8-rørstriber, mikroliter 96/384/1536-brøndplade og mikrofluidiske nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer1,,2,,3,,4,5,6,7. Svarende til nedskæringer funktionen størrelse transistorer på integrerede kredsløb chips i halvlederindustrien i de seneste årtier, er bio / kemiske mikroreaktorer går gennem volumenreduktion og systemintegration. Sådanne små værktøjer har haft en dybtgående indvirkning på celle-baseret eller celle-fri syntetisk biologi, biofremstilling, og høj-throughput prototyping og screening8,9,10,11,12. Dette dokument beskriver vores seneste indsats for at udvikle en unik dråbearray og demonstrerer dens anvendelse i CFPS13, en grundlæggende teknologi for syntetiske biologi- og molekylære screeningssamfund14. Især giver vi bevidst en optimeret og billig protokol for at gøre FemDA-enheden tilgængelig for alle. Den billige og let at håndtere protokol for miniaturiseret enhed ville bidrage til uddannelsesmæssige formål universiteter og bidrage til at sprede teknologien.
FemDA forbereder femtoliterdråber ved en ultrahøj tæthed på 106 pr. 1 cm2 på et plant glas substrat. Vi belagt en hydrofob polymer, CYTOP15,på glasset substrat og selektivt ætset (fjernet) CYTOP på foruddefinerede positioner til at generere en mikrokammer array på substratet. Således er den resulterende mikrokammer består af en hydrofob sidevæg (CYTOP) og en hydrofil bund (glas). Når sekventielt strømmende vand og olie over den mønstrede overflade, kan vandet blive fanget og forseglet i mikrokammer. Den hydrofile-i-hydrofobiske struktur er afgørende for at afvise vand uden for mikrokammeret, isolere individuelle mikroreaktorer og bevare en lille vandig opløsning inde i femtoliterrummet. Den unikke egenskab blev anvendt med succes til fremstilling af vand-i-olie dråber og lipid tolag mikrokommenter16,17. Sammenlignet med prototypenenhed 16,vi først optimeret mikrofabrikation proces til at realisere en fuldstændig fjernelse af CYTOP polymer samt en fuld eksponering af glasbunden. CYTOP er en speciel fluorpolymer med ekstremt lav overfladespænding (19 mN/m) lavere end for konventionelle mikroreaktormaterialer som glas, plast og silikone. Dens gode optiske, elektriske og kemiske ydeevne er allerede blevet udnyttet i overfladebehandling af mikrofluidic enheder18,19,,20,,21,,22,23,24. I FemDA-systemet skal oliens overfladespænding være lavere end den faste overflade25for at opnå god befugtning af olien på CYTOP-overfladen. Ellers er den flydende olie i kontakt med den faste overflade tendens til at blive sfærisk snarere end at sprede sig over overfladen. Desuden fandt vi, at nogle populære perfluorcarbonolier (f.eks. 3M FC-40)16 og hydrofluoretherolier (f.eks. 3M Novec-serien) kan opløse CYTOP som følge af CYTOP’s amorfe morfologi, som er fatal for kvantitativ måling og vil være tvivlsom med hensyn til krydskontaminering blandt dråber. Heldigvis identificerede vi en biokompatibel og miljøvenlig olie, der udviser lavere (< 19 mN/m) overfladespænding13. Vi fandt også et nyt overfladeaktivt stof, der kan opløses i den valgte olie og funktion i en lav koncentration (0,1%, mindst 10 gange lavere end tidligere rapporteret populære dem26,,27)13. Den resulterende vand / olie interface kan stabiliseres af det overfladeaktive stof. På grund af oliens høje fordampningshastighed, efter skylningen med olien, anvendte vi en anden biokompatibel og miljøvenlig olie til at erstatte den første til at forsegle mikrokammerene. Vi kalder den første olie (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) “flush olie” og den anden olie (Fomblin Y25) den “forsegling olie,” hhv.
Den to-trins olie-forsegling strategi kan realisere en robust dannelse af femtoliter dråbe array inden for få minutter og uden sofistikeret instrumentering. På grund af fordampningsproblemet er det blevet anset for udfordrende at generere mikroreaktorer, der er mindre end picolitervolumener28. FemDA tog fat på dette problem ved systematisk at optimere de materialer og processer, der anvendes til fremstilling af mikroreaktorer/dråber. Flere bemærkelsesværdige træk ved de resulterende dråber omfatter høj ensartethed (eller monodispersity), stabilitet og biokompatibilitet på femtoliter skalaen. Variationskoefficienten (CV) for dråbevolumenet er kun 3% (uden vignettering korrektion for mikroskopiske billeder), det mindste CV blandt dråbeplatforme i verden, hvilket sikrer en meget parallel og kvantitativ måling. Femtoliterdråben er stabil i mindst 24 timer uden krydskontaminering blandt dråber ved stuetemperatur, hvilket er værdifuldt for en pålidelig tidsmåling. Med hensyn til biokompatibilitet lykkedes det os at syntetisere forskellige proteiner fra en enkelt kopi skabelon DNA i femtoliter dråbe, som tidligere var blevet anset for vanskeligt ellerineffektivt 29,30. Det ville være værd at belyse, hvorfor nogle proteiner, der kan syntetiseres i FemDA ikke kan syntetiseres i andre dråbesystemer. FemDA var ikke blot en teknisk fremgang, men indså også en hidtil uset kvantitativ måling, der kan korrelere proteinudbyttet (som afspejlet af dråbens fluorescensintensitet) til antallet af skabelon-DNA-molekyler i hver dråbe. Som følge heraf viste histogrammet for fluorescensintensiteten af dråber fra FemDA-baserede CFPS en diskret fordeling, der kan fint monteres ved en sum gaussisk fordelinger af lige top-til-peak intervaller. Desuden var sandsynligheden for forekomst af dråber, der indeholder forskellige antal DNA-molekyler, en perfekt pasform til en Poisson-fordeling31. Således kan de forskellige proteinudbytte i hver dråbe normaliseres baseret på den diskrete fordeling. Denne kritiske funktion giver os mulighed for at adskille enzymatiske aktivitet oplysninger fra den tilsyneladende intensitet, der ikke har været tilgængelig med andre mikroreaktor platforme endnu. Eksisterende mikrofluidiske celle- og dråbesorteringssystemer er dygtige til fuldautomatisk sortering og gode til at koncentrere prøverne , men kan nogle gange kun udsende et relativt bredt eller langthalet histogram i det analytiske aspekt32,33. Vores meget kvantitative og biokompatible FemDA-system sætter et nyt benchmark og en høj analytisk standard inden for mikroreaktorudvikling.
De olier og overfladeaktive stoffer, der kan anvendes til fremstilling af dråber, er stadig meget begrænsede34. Kombinationen af ASAHIKLIN AE-3000 og SURFLON S-386 etableret i FemDA er et nyt medlem af det voksende arsenal af den fysiokemiske grænseflade mellem den vandige fase og oliefase13. Den nye grænseflade i FemDA er fysisk stabil, kemisk inert, og biologisk kompatibel med den komplekse transskription, oversættelse, og post-translationelle modifikation maskiner til mange slags proteiner13. Det ville være temmelig attraktivt at finde et protein, der ikke kan syntetiseres i dråbeindstillingerne i stedet. Desuden er omkostningsbesparelserne for reagenser mere tydelig i femtoliterdråbesystemet end i nanolit- og picoliterreaktorsystemer35,36. Især vil der ofte være en stor død volumen, som hovedsagelig er forårsaget af slanger eller eksterne forsyninger, i mikrofluidic dråbe generation systemer, men ikke i vores FemDA. Array formatet er også begunstiget af gentagne og detaljerede mikroskopiske karakterisering (svarende til såkaldte høj-indhold analyse) for hver enkeltreaktor 37, snarere end kun et enkelt øjebliksbillede for en hurtig bevægelse objekt. Femtoliterskalaen gjorde det muligt at integrere over en million reaktorer på et område i fingerstørrelse, mens det samme antal nanolitreaktorer (hvis det findes) kræver et areal på kvadratmeter, hvilket utvivlsomt ville være upraktisk at fremstille eller anvende et sådant system.
Den meget kvantitative måling baseret på de meget ensartede, stabile og biokompatible dråber i FemDA gjorde det muligt for diskret distribution, det unikke ved vores undersøgelse adskiller sig fra andre. Vi optimerede og detaljeret mikrofabrikations- og dråbedannelsesprocesserne i dette dokument. Der er flere kritiske trin i den etablerede protokol.
For det første bestemmer den ensartede belægning af meget tyktflydende CYTOP polymer på det rektangulære tynde glassubstrat i høj grad k…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI tilskud nummer JP18K14260 og budgettet for Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Vi takker Shigeru Deguchi (JAMSTEC) og Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) for at levere karakteriseringsfaciliteterne. Vi takker Ken Takai (JAMSTEC) for kommerciel softwaresupport. Den mikrofabrikation blev gennemført på Takeda Sentanchi Supercleanroom, University of Tokyo, støttet af “Nanotechnology Platform Program” af Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.
(3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
Air blower | Hozan | Z-263 | |
Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |