脑切片和原细胞培养中金字塔神经元的弹道标记
Summary
我们提出了一种用于标记和分析金字塔神经元的协议，这对于评估神经元和树突脊柱的潜在形态变化至关重要，这些变化可能是神经化学和行为异常的基础。
Abstract
据报道，树突椎的大小和形状与其结构可塑性有关。为了识别金字塔神经元和树突脊柱的形态结构，可以使用弹道标记技术。在本协议中，金字塔神经元标有DilC18（3）染料，并使用神经元重建软件进行分析，以评估神经元形态和树突脊柱。为了研究神经元结构，进行了树突分支分析和Sholl分析，使研究人员能够分别对树突分支的复杂性和神经元树体的复杂性进行推论。树突脊柱的评估使用重建软件不可或缺的自动辅助分类算法进行，该算法将脊柱分为四类（即薄、蘑菇、短根、纤维素）。此外，还选择另外三个参数（即长度、头部直径和体积）来评估树突脊柱形态的变化。为了验证弹道标记技术的广泛应用潜力，成功地标记了体外细胞培养的金字塔神经元。总体而言，弹道标记方法是独特的，可用于可视化大鼠不同大脑区域的神经元，与复杂的重建软件相结合，使研究人员能够阐明潜在的机制神经认知功能障碍。
Introduction
2000年，Gan等人描述了神经系统中单个神经元和胶质的快速标记技术，将各种嗜脂染料结合在一起，允许同时标记许多不同颜色的脑细胞11，2。2最近，Seabold等人3描述了一种弹道标记技术，该技术将荧光染料（Dil）引入脑切片的神经元。弹道标记是一种多功能染色技术，因其在多种动物种类和不同年龄范围内使用的能力而广受赞赏。此外，它可以与免疫染色相结合，以识别脑细胞的亚群3。与传统技术（如Golgi-Cox银浸渍、微注射）4相比，弹道标记提供了一个更清晰地区分形态特征的机会，包括树突脊柱，这一特征对于绘制关于神经元复杂性和突触连通性5的推论至关重要。
外泄金字塔神经元的特点是单个，大的树突，多个较短的基底树突，和数以千计的树突脊柱6。金字塔神经元存在于与高阶认知处理相关的多个大脑区域，包括前额叶皮质（PFC）和海马。在PFC中，金字塔神经元在II/III层和第五层被观察到，每个神经元都表现出独特的形态。具体来说，PFC第二/III层中的金字塔神经元具有比第五层6中的金字塔神经元较短的尖树突和更少的分支。在海马区内，金字塔神经元位于CA1和CA3区域，每个区域都显示不同的形态。具体来说，CA1 区域中的金字塔神经元表现出更独特的尖突，与 CA3 区域6相比，分支远离躯体。
在PFC和海马的金字塔神经元上的腺突脊柱是兴奋突触7的主要部位。树突脊柱的形态特征，被经典地分为三大类（即薄、小根或蘑菇8），与兴奋突触9的大小有关。细脊椎，其特点是长，薄的脖子，小球状头，和较小的脑后密度，是更不稳定的，并发展较弱的连接。然而，蘑菇脊柱，有一个更大的树突脊柱头，被认为是形成更强的突触连接，其更大的尺寸所产生的效果。与此形成鲜明对比的是，短根脊柱没有脊柱颈部，头部和颈部体积比约为8。在海马区内，也可以观察到分支脊柱，即脊柱有多个头，从同一树突脊柱颈部10中浮现出来。因此，树突脊柱的形态变化可以反映功能和结构能力。此外，研究表明，树突椎的大小和形状与结构可塑性有关，导致小脊柱参与学习和注意力，而更大，更稳定的脊柱，参与长期过程，包括记忆11。此外，树突状脊柱沿树突的分布可能与突触连接55，1212相关。
因此，本方法论文件有三个目标：1） 提出我们的弹道标记方案，其成功率（即符合选择标准的神经元和适合分析的神经元）为 83.3%5,5、12、13,13和跨多个大脑区域（即 PFC、核积液、海马区）;2） 证明该技术的通用性及其在体外生长的神经元中的应用;3） 详细说明神经元重建软件中使用的方法以及可以从此类数据中提取的推论。
Protocol
Representative Results
Discussion
在此协议中，我们描述了一种针对大鼠大脑和体外生长的神经元的通用标记技术。此外，我们报告利用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突脊柱的方法。对神经元形态学和树突脊柱的评估提供了一个机会，以确定树突分枝的复杂性、神经元树干复杂性、树突脊柱形态和突触连通性的变化。
在进行协议时，研究人员应特别注意几个步骤。首先，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由NIH拨款HD043680、MH106392、DA013137和NS100624资助。
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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