בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי לתייג ולנתח נוירונים באמצע, אשר קריטי להערכת שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובקוצים הדנדריטים שעלולים להיות מומים נוירוכימיקלים והתנהגותיים.
Abstract
דווח כי גודל וצורה של השדרה הדנדריטים קשורה הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם. כדי לזהות את המבנה המיורפולוגי של הנוירונים ושידולי הדנדריטים, ניתן לעשות שימוש בטכניקת תיוג בליסטיים. בפרוטוקול הנוכחי, הנוירונים העצביים מתויגים עם DilC18 (3) לצבוע וניתח באמצעות תוכנת שחזור עצבי להעריך מורפולוגיה עצבית ושפה דנדריטי. כדי לחקור את המבנה העצבי, ניתוח הסתעפות הדנדריטים וניתוח שולבה מבוצעים, ומאפשר לחוקרים לצייר מסקנות על מורכבות הסתעפות הדנדריטים והמורכבות העצבית העצביים, בהתאמה. הערכה של השדרה הדנדריטי מתבצעת באמצעות הסיווג האוטומטי באמצעות אלגוריתם מיון אינטגרלי לתוכנה שחזור, אשר מסווג את הקוצים לתוך ארבע קטגוריות (כלומר, דק, פטריות, שמנה, שמנת, פילפיאה). יתר על כן, שלושה פרמטרים נוספים (כלומר, אורך, ראש קוטר, ונפח) נבחרים גם להעריך שינויים במבנה השדרה הדנדריטי. כדי לאמת את הפוטנציאל של היישום הרחב של טכניקת תיוג בליסטי, הנוירונים בצורה מרחבית מתוך תרבות תא מבחנה בהצלחה מתויג. בסך הכל, שיטת התיוג הבליסטי היא ייחודית ושימושית להמחיש נוירונים באזורי מוח שונים בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת, מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים המשמשים כבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי.
Introduction
בשנת 2000, גן ואח ‘ תיאר טכניקת תיוג מהירה לנוירונים בודדים ולגליה במערכת העצבים שבשילוב צבעי ליפוליים שונים, ומאפשר תיוג סימולטני של תאי מוח רבים בצבעים שונים1,2. לאחרונה, טכניקת תיוג בליסטי תוארה על ידי סיאולד ואח ‘3 שהוצגו צבעי פלורסנט (דיל) לתוך הנוירונים של פרוסות המוח. טכניקה מכתימה רב-תכליתי, תיוג בליסטי הוא מוערך על יכולתה להיות מנוצל במינים רבים בעלי חיים ולאורך מגוון רחב של גילאים. יתר על כן, זה יכול להיות משולב עם כתמים חיסוני לזהות אוכלוסיות משנה של תאי המוח3. לעומת טכניקות מסורתיות (למשל, Golgi-קוקס כסף הספגה, microinjection)4, תיוג בליסטי מעניקה הזדמנות להבדיל באופן ברור יותר מאפיינים מורפולוגיים, כולל השדרה הדנדריטי, תכונה קריטית לציור מסקנות על מורכבות עצבית וקישוריות סינפטית5.
מרגש הנוירונים מתאפיין באחד, דנדריטים הרשמי הגדול, מספר דנדטים בסיס קצר, ואלפי שובך הדנדריטים6. הנוירונים האלה מצויים באזורי המוח המרובים הקשורים לעיבוד קוגניטיבי גבוה יותר, כולל קליפת ראש הדור הקדמי (טוראי ראשון) ו ההיפוקמפוס. בטוראי הראשון, הנוירונים באמצע המבנה מתבוננים בשכבות II/III ושכבה V, כאשר כל אחד מהם מציג מורפולוגיה ייחודית. במיוחד, הנוירונים באמצע שכבה II/III של הטוראי הראשון יש הדנדריטים פסגה קצר יותר ופחות הסתעפות מאשר הנוירונים באמצע השכבה V6. בתוך ההיפוקמפוס, הנוירונים באמצע הפירמידה ממוקמים הן באזורים CA1 ו CA3, עם כל הצגת מורפולוגיות נפרדות. באופן ספציפי, הנוירונים באזור CA1 מוצג הדנדריטים הרשמי הייחודי יותר, עם הסתעפות המתרחשים רחוק יותר הסומה, ביחס לאזור CA36.
הדנדריטים הדנדריטי על הנוירונים באמצע הפירמידה הן הראשון ההיפוקמפוס הם האתר העיקרי של סינפסות מרגש7. מאפיינים מורפולוגיים של שתדלתיים דנדריטים, אשר מאופיינים באופן קלאסי לתוך שלוש קטגוריות ראשיות (כלומר, דק, קלוש, או פטריות8), היו קשורים בגודל של הרגש סינפסה9. השדרה הדק, המאופיינת בצוואר ארוך, דק, ראש בולבוסי קטן, וצפיפות הפוסט-סינפטית הקטנה יותר, אינם יציבים יותר ומפתחים התקשרויות חלשות יותר. עם זאת, שדרה פטריות, אשר יש ראש השדרה הדנדריטי גדול יותר, מוכרים ליצירת קשרים סינפטית חזקים יותר, אפקט כתוצאה מהגודל הגדול שלהם. בניגוד חד, שדרה שולי הוא נטול צוואר עמוד השדרה, המציגות יחס שווה ערך ראש וצוואר שווים8. בתוך ההיפוקמפוס, שדרה הסתעפות יכול להיות גם נצפתה, לפיה עמוד השדרה יש ראשים מרובים היוצאים מן הצוואר הדנדריטי זהה10. לכן, השינויים הורפולוגיים של הקוצים הדנדריטים יכולים לשקף פונקציונליות וקיבולת מבנית. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי הגודל והצורה של השדרה הדנדריטי מתייחס הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם, המוביל את הרעיון כי הקוצים הקטנים מעורבים בלמידה ובתשומת לב, בעוד שבעמודי השדרה הגדולים והיציבים יותר, מעורבים בתהליכים ארוכי טווח, כולל זיכרון11. בנוסף, הפצת הקוצים הדנדריטים לאורך הדנדריטים עשויה להיות קשורה לקישוריות סינפטית5,12.
לפיכך, הנייר המתודולוגי הנוכחי כולל שלוש מטרות: 1) הצגת הפרוטוקול שלנו עבור תיוג בליסטי, אשר כבר מנוצל עם שיעור הצלחה (כלומר, הנוירונים לפגוש קריטריונים הבחירה מתאים לניתוח) של 83.3%5,12,13 וברחבי מחוזות המוח מרובים (כלומר, טוראי ראשון, 2) להפגין את היכולת הגנריות של הטכניקה ואת יישומו לנוירונים שגדלו בתוך מבחנה; 3) פירוט המתודולוגיה הנמצאת בשימוש בתוכנת שחזור עצבית ומסקנות שניתן לשאוב מנתונים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקת תיוג רב-תכליתי עבור נוירונים ממוח החולדה ואלה שגדלו בתוך מבחנה. יתרה מזאת, אנו מדווחים על המתודולוגיה לניצול תוכנת שחזור עצבית ושחזור עצבי כמותי להערכת המבנה העצבי והשדרה הדנדלית. הערכה של מורפולוגיה עצבית ושדרה דנדריטי מספק הזדמנות לקבוע שינויים במורכבות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
