脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識
Summary
神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。
Abstract
樹状棘の大きさや形は、その構造的可塑性に関連していると報告されています。錐体ニューロンと樹状棘の形態構造を同定するために、弾道標識技術を利用することができる。本プロトコルでは、錐体ニューロンはDilC18(3)色素で標識され、ニューロンの再構成ソフトウェアを用いて神経の形態と樹状脊椎を評価するために分析されます。神経構造を調べるため、樹枝解析とSholl解析が行われ、樹状分岐の複雑さと神経細胞の複雑性に関する推論をそれぞれ描くことができます。樹状脊椎の評価は、脊椎を4つのカテゴリ(すなわち、薄い、キノコ、スタビー、フィロポディア)に分類する再構成ソフトウェアに不可欠な自動補助分類アルゴリズムを使用して行われます。さらに、樹状脊椎形態の変化を評価するために、さらに3つのパラメータ(すなわち、長さ、頭の直径、および体積)も選択される。弾道標識技術の広い応用の可能性を検証するために、インビトロ細胞培養からの錐体ニューロンに正常に標識された。全体として、弾道ラベリング法は、高度な再構築ソフトウェアと組み合わせて、ラットの異なる脳領域のニューロンを視覚化するのにユニークで有用であり、研究者は基礎となる可能性のあるメカニズムを解明することができます神経認知機能障害.
Introduction
2000年、Gan et al. は、種々の親油性色素を組み合わせた神経系における個々のニューロンおよびグリアに対する迅速な標識技術を説明し、異なる色11,22を有する多くの脳細胞の同時標識を可能にする。最近では、脳スライスのニューロンに蛍光色素(Dil)を導入したシーボルトら3によって弾道標識技術が説明された。多目的な染色技術、弾道標識は、複数の動物種で、年齢の広い範囲にわたって利用される能力のために高く評価される。さらに、免疫染色と組み合わせて、脳細胞3の亜集団を同定することができる。従来の技術(例えば、ゴルジ・コックス銀含浸、マイクロインジェクション)4と比較して、弾道標識は樹状棘を含む形態学的特徴をより明確に区別する機会を与える。5
興奮性錐体ニューロンは、単一の大きな尖形樹状突起、複数の短い基礎樹状突起、および樹状脊椎の数千人によって特徴付けられる6。錐体ニューロンは、前頭前野(PFC)および海馬を含む高次認知処理に関連する複数の脳領域で発見される。PFCでは、錐体ニューロンは層II/IIIおよび層Vで観察され、それぞれが独特の形態を示す。具体的には、PFCの層II/IIIの錐体ニューロンは、層V6の錐体ニューロンよりも短い有端樹状突起および枝分かれが少ない。海馬内では、錐体ニューロンはCA1とCA3の両方の領域に位置し、それぞれが異なる形態を示しています。具体的には、CA1領域における錐体ニューロンは、より特徴的な尖体樹状突起を呈し、分岐は、CA3領域6に対して、ソーマから遠く離れた場所で生じる。
PFCと海馬の両方の錐体ニューロン上の樹状脊椎は興奮シナプス7の主要な部位である。樹状脊椎の形態学的特徴は、古典的に3つの主要なカテゴリ(すなわち、薄い、頑固、またはキノコ8)に特徴付けられるが、興奮性シナプス9の大きさに関連している。細い棘は、長くて細い首、小さな球根の頭部、およびより小さなポストナプティクス密度によって特徴付けられるが、より不安定であり、弱い接続を開発する。しかし、より大きな樹状脊椎の頭部を有するキノコ脊椎は、より強いシナプス接続を形成することが認められ、その大きなサイズに起因する効果がある。鋭い対照的に、頑固な棘は脊柱首を欠き、頭頸部容積比8にほぼ等しい。海馬内では、分岐した脊椎も観察され、それによって脊椎は同じ樹状脊椎頸部10から出現する複数の頭部を有する。したがって、樹状脊椎の形態学的変化は、機能性および構造的能力を反映する可能性がある。さらに、樹状脊椎の大きさと形状が構造的可塑性に関連していることを実証した研究は、小さな棘が学習と注意に関与しているのに対し、より大きく、より安定した脊椎は、記憶11を含む長期的なプロセスに関与しているという考えにつながる。さらに、樹状突起に沿った樹状脊椎の分布は、シナプス接続性5,1212と関連している可能性がある。
したがって、本方法論的論文には3つの目標があります:1)成功率(すなわち、ニューロンが選択基準を満たし、分析に適しているニューロン)で利用された弾道標識のプロトコルを83.3%5、12、13と複数の脳領域(すなわち、PFC、側坐核、海馬)にわたって提示する。5,12,132)この技術の一般化性と、インビトロで成長したニューロンへの応用を実証する。3) 神経再建ソフトウェアで利用される方法論と、そのようなデータから引き出すことができる推論を詳述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ラット脳とインビトロで成長したニューロンの両方のニューロンに対する汎用性の高い標識技術について説明する。さらに、神経変態と神経再建定量解析ソフトウェアを用いて、神経形態や樹状脊椎を評価する方法論を報告する。神経形態と樹状脊椎の評価は、樹状分岐の複雑さ、ニューロンの樹状樹状の複雑さ、樹状脊椎形態、シナプス接続性の変化を決定する機会?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金HD043680、MH106392、DA013137、およびNS100624によって資金提供されました。
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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