Ballistisk merking av pyramidale nevroner i hjerneskiver og i primær cellekultur
Summary
Vi presenterer en protokoll for å merke og analysere pyramidale nevroner, noe som er avgjørende for å evaluere potensielle morfologiske endringer i nevroner og dendrittiske spines som kan ligge til grunn for nevrokjemiske og atferdsmessige abnormiteter.
Abstract
Det har blitt rapportert at størrelsen og formen på dendrittiske spines er relatert til deres strukturelle plastisitet. For å identifisere den morfologiske strukturen til pyramidale nevroner og dendrittiske spines, kan en ballistisk merkingsteknikk benyttes. I den nåværende protokollen er pyramidale nevroner merket med DilC18(3) farog analysert ved hjelp av nevronal rekonstruksjonsprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. For å undersøke nevronal struktur utføres dendrittitisk forgreningsanalyse og Sholl-analyse, slik at forskere kan trekke slutninger om dendrittitisk forgrening skantkompleksitet og nevronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen av dendrittiske spines utføres ved hjelp av en automatisk assistert klassifiseringsalgoritme integrert i rekonstruksjonsprogramvaren, som klassifiserer spines i fire kategorier (dvs. tynn, sopp, stubby, filopodia). Videre velges ytterligere tre parametere (dvs. lengde, hodediameter og volum) også for å vurdere endringer i dendrittisk ryggradmorfologi. For å validere potensialet for bred anvendelse av den ballistiske merkingsteknikken, ble pyramidale nevroner fra in vitro cellekultur merket. Samlet sett er den ballistiske merkingsmetoden unik og nyttig for å visualisere nevroner i forskjellige hjerneregioner hos rotter, som i kombinasjon med sofistikert rekonstruksjonsprogramvare gjør det mulig for forskere å belyse de mulige mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon.
Introduction
I 2000 beskrev Gan et al. en rask merkingsteknikk for individuelle nevroner og glia i nervesystemet som kombinerte ulike lipofile fargestoffer, noe som muliggjør samtidig merking av mange hjerneceller med forskjellige farger1,2. Mer nylig ble en ballistisk merkingsteknikk beskrevet av Seabold et al.3 som introduserte fluorescerende fargestoffer (Dil) i nevronene i hjerneskiver. En allsidig fargeteknikk, ballistisk merking er verdsatt for sin evne til å bli utnyttet i flere dyrearter og over et bredt spekter av aldre. Videre kan det kombineres med immunfarging for å identifisere underpopulasjoner av hjerneceller3. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker (f.eks. Golgi-Cox sølv impregnering, mikroinjeksjon)4, gir ballistisk merking en mulighet til å tydeligere skille morfologiske egenskaper, inkludert dendrittiske spines, en funksjon som er avgjørende for å tegne slutninger om nevronal kompleksitet og synaptisk tilkobling5.
Eksitatoriske pyramidale nevroner er preget av en enkelt, stor apical dendritt, flere kortere basal dendritter, og tusenvis av dendrittiske spines6. Pyramidale nevroner finnes i flere hjerneregioner relatert til høyere orden kognitiv behandling, inkludert prefrontal cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramidale nevroner i lag II/III og lag V, med hver utstilling av unik morfologi. Spesielt pyramidale nevroner i lag II / III av PFC har en kortere apical dendritt og mindre forgrening enn pyramidale nevroner i lag V6. Innenfor hippocampus, pyramidale nevroner ligger i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser distinkte morfologier. Spesielt viser pyramidale nevroner i CA1-regionen en mer særegen apical dendritt, med forgrening som skjer lenger fra soma, i forhold til CA3-regionen6.
Dendrittiske spines på pyramidale nevroner i både PFC og hippocampus er det primære stedet for eksitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaper av dendrittiske spines, som er klassisk preget i tre primære kategorier (dvs. tynn, stubby eller sopp8), har vært relatert til størrelsen på eksitatoriske synapse9. Tynne spines, preget av en lang, tynn hals, lite bulbous hode, og mindre postsynaptiske tettheter, er mer ustabile og utvikler svakere forbindelser. Imidlertid er soppspines, som har et større dendrittisk ryggradshode, anerkjent for å danne sterkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge av deres større størrelse. I skarp kontrast er stubby spines blottet for en ryggradsnakke, og viser et omtrent lik hode- og nakkevolumforhold8. Innenfor hippocampus kan forgrenede spines også observeres, hvorved ryggraden har flere hoder som kommer fra samme dendrittiske ryggraden halsen10. Derfor kan morfologiske endringer av dendrittiske spines reflektere funksjonalitet og strukturell kapasitet. Videre har studier vist at størrelsen og formen på dendrittiske spines er knyttet til deres strukturelle plastisitet, noe som fører til ideen om at små spines er involvert i læring og oppmerksomhet, mens større, mer stabile spines, er involvert i langsiktige prosesser, inkludert minne11. I tillegg kan fordelingen av dendrittiske spines langs dendritten være forbundet med synaptisk tilkobling5,12.
Dermed har dagens metodiske papir tre mål: 1) Presenter vår protokoll for ballistisk merking, som har blitt benyttet med en suksessrate (dvs. nevroner som oppfyller utvalgskriteriene og egnet for analyse) på 83,3%5,12,13 og på tvers av flere hjerneregioner (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generalizability av teknikken og dens anvendelse til nevroner dyrket in vitro; 3) Detalj metodikken som brukes i neuronal rekonstruksjon programvare og slutninger som kan trekkes fra slike data.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en allsidig merkingsteknikk for nevroner fra både rottehjernen og de som dyrkes in vitro. Videre rapporterer vi metodikken for bruk av nevronal rekonstruksjonprogramvare og nevronal rekonstruksjon kvantitativ analyseprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. Vurderingen av nevronal morfologi og dendrittiske spines gir en mulighet til å bestemme endringer i dendrittiske forgreningskompleksitet, nevronal arbor kompleksitet, dendrittisk ryggraden morfologi og syn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-bevilgninger HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
